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1、中文译文用生化和同位素地球化学方法了解伊比利亚lower Guadiana河地区铅污染对环境和公众健康的影响：一种淡水双壳类研究 摘要：铅是一种水生生态系统中未知其生物作用的一种天然的成分，剧毒。它的毒性是因为它能模仿生物的重要金属，通过脂质过氧化物（LPO）产生摸损伤。大多数铅中毒的症状被认为是铅能干扰一种重要的酶-氨基酮戊酸脱水酶（ALAD）的活性能被铅严重抑制。本文工作的目的是研究铅污染水平和铅污染对生活在lower Guadiana河（葡萄牙和西班牙）中淡水双壳类动物Corbicula fluminea的影响（对ALAD和过氧化反应激生物标志物LPO的影响）中。Lower Guadia
2、na河是一条主要的河流系统，历史上人因为开采矿石和人为因素的介入而受到影响。结果表明，ALAD酶的活性与组织中铅总浓度呈负相关，说明ALAD已成为Corbicula fluminea铅暴露的一个重要生物标志物。为了说明Corbicula fluminea铅暴露的来源，高精度的206Pb/204Pb，207Pb/204Pb，208Pb/204/Pb比例确认，历史上在伊比利亚黄铁矿带的开采活动，是lower Guadiana河铅污染的主要来源。同位素结果也提供了针对降雨和河流水资源管理的明显的季节和地理差异。另外，在接近人口中心的Corbicula fluminea中检出的铅还来源于其它的软体动物
3、，从而增加了Corbicula fluminea作为一个淡水生物监测体的多样性。总而言之，这项研究突出了自然生态系统用于水质监测的价值和它们对公共健康评估和监测的重要性。引言这项工作的主要目的是研究来自lower Guadiana河，在伊比利亚南部最具有经济性和战略性的河流的各点位淡水双壳类Corbicula fluminea河中的铅污染水平和对其生物化学的影响。虽然近期Corbicula fluminea被引入伊比利亚半岛，但Corbicula fluminea已被广泛的用作淡水及河口生态系统中评价金属污染的生物指标（Araujo et al, 1993）铅对Corbicula flumin
4、ea的生态毒理学效应取决于-氨基酮戊酸脱水酶（ALAD）的活性和脂质过氧化物（LPO）的水平。为了了解双壳类中铅暴露的来源，研究还对Corbicula fluminea中铅的同位素组成进行了测定。在水生系统中人为因素导致的铅存在主要是由于含铅的燃料，金属冶炼和采矿活动（Veron et al, 1998）。铅的毒性来自它能够模仿生物体必需的重要金属，主要是钙、铁和锌(Neff, 2002)的生物活动。铅能够结合并与这些重金属分子产生作用，当这些重金属被铅取代后，这些分子功能发生改变并不能执行其主要任务（如生物体生命活动必需的酶的产生）。铅能抑制血红素生物合成途径中的3种酶的活性：-氨基酮戊酸脱
5、氢酶活性（ALAD），coporphyrinogen氧化酶和亚铁螯合酶，但对ALAD的影响最大（Kelada et al.2001）。红细胞ALAD的抑制程度往往被用于临床上评估人类铅中毒程度。在分子水平上，铅在金属结合位点取代锌离子，而不是活性位点（Warren et al.1998），通过改变酶四级结构产生抑制作用。ALAD受到抑制导致氨基乙酰丙酸合酶的增加（Kelada et al, 2001）。ALAD是血红素生物合成途径中的第二个酶，主要在胞浆内，在正常细胞的血红素合成中不被抑制。这种酶催化2分子的5-氨基酮戊酸（ALA）凝结形成1分子PBG，并在所有组织中表达。但是在脊椎动物中，表
6、达水平最高的则在红细胞和肝脏中(Wetmur, 1994)。这种酶活性能被环境中诸如铅等毒物所抑制（Conner and Fowler,1994）。铅毒性的最基本的影响之一是抑制血红素的合成。虽然-氨基酮戊酸脱水酶已被广泛用作人类，哺乳类和鱼类中铅暴露的研究，仍然很少有报道应用于双壳类的研究，这可能与双壳类缺乏呼吸色素像血红蛋白和血蓝蛋白（Terwilliger，1998）有关。因为在双壳类中，过氧化物酶和细胞色素C是主要的血色素蛋白。脂质过氧化物（LPO）是细胞损伤的一个重要特征，主要来源于生物膜上的自由基反应，因为细胞膜上富含不饱和脂肪酸（PUFA）(Chesseman, 1982)。Ha
7、lliwell and Gutteridge (1984)指出金属的更替可能刺激PUFA的过氧化反应，主要是催化氧自由基的形成或者，最有可能的是催化之前形成的氢过氧化物的解离。一些研究结果显示铅对LPO的作用主要与铅的毒性有关，因为铅的存在促进体内脂质过氧化反应。在lower Guadiana河排水流域（图1），包括西班牙和葡萄牙，土地几乎都用于农业方面（charo et al, 2001）。然而，最北的一段，地理上属于伊比利亚黄铁矿地质带（IPB），一条250公里60公里宽，东西走向的泥盆纪地质时期的火山和沉积岩带，包含大量铁、铜混合物沉积，还有含有小量铅、锌(Barriga et al.1
8、997;saez et al.1999)。开发的历史可以追溯到史前时代，但在19世纪和20世纪最大规模金属提炼的时代。在IPB的南部，该流域是由一些年轻的石炭纪时期的沉积岩组成。相比之下，是非矿物化的。虽然IPB地区的开采一部分现在已经停止，但这些开采活动对lower Guadiana河的环境和生态造成的影响在很大程度上是未知的。最近的关于悬浮在Guadiana河口的颗粒物（SPM）的研究显示(Caetano et al.,2006)，在中等流量的季节，如在冬季降雨时段）SPM由含3-12%铁、20-80ppm的铅和高水平的铜和锌等富含离子的颗粒物组成。酸性矿井废水也从葡萄牙和西班牙的采矿点被
9、排到瓜迪亚纳河流域，其中含有超过2000ppb的铅和15000ppm的铜（未公布的数据，UTPIA项目）。因此假定废矿和未处理的酸性矿水的排放是lower Guadiana河铅污染主要来源是值得相信的。为了验证这个假定和评价其它的人为活动，高精度铅同位素研究被应用于在Guadiana的双壳类。铅的同位素被广泛用于环境研究(Labonne et al.2001;Hansmann and Koppel, 2000)，其效应取决于对最终成分的认识。在这种情况下，Corbicula fluminea作为lower Guadiana河中大量的，多来源的铅同位素研究瓜迪亚纳河流域铅同位素研究的一部分，因此
10、可能获得一个被正确定以的，包括最终成员人为的和环境地球化学成分的丰富的数据库。（UTPIA项目，见鸣谢）铅同位素研究特别适合生物系统，因为它们的组成完全不受铅浓度的影响，通常也被认为不受生化过程的影响。虽然一些研究人员提出存在生物介导的质谱依赖的成分可能性(Reimann et al, 2008)，但是大量的依赖当前证据的结果显示这个影响微不足道。因此，铅同位素的研究将系统地有助于了解其污染的途径。2.研究领域研究地区覆盖Guadiana 河最低的56km 地区：Guadiana河在tvila Real de stoantonio-Ayamonte 地区(图1)汇入大西洋前的56公里区域。为了
11、量化铅污染C.fluminea的影响，选定了该河流(表1)在葡萄牙境内的五个点来检测该地 经采矿后的环境条件。点位1，多明戈（37 4013N, 7 30 29 W），与一个堆积大量矿山废弃物相连的淡水湖泊的休闲沙滩。虽然不在主流域，但湖水通过污染的支流与多明戈采矿区相通。反方向又流入Guadiana 河主流域，北部点位3。点位2，梅尔图拉（37 38 78N, 7 39 13 W。）该地区是Guadiana 河缘，是潮汐影响的瓜迪亚纳河的最后点，靠近梅尔图拉镇（居民约8700人）。点位3，波马朗(37 33 37 N, 7 32 00 W)河缘点，尚萨和瓜迪亚纳河汇合的下游。波马朗是个存储和
12、运输从多明戈区来的黄铁矿的重要战略位置。点位4，阿尔科廷（37 28 29N, 7 2856 W）阿尔科廷镇下游的局部封闭沙滩（居民约1100人）。点位5，奥德莱蒂（37 20 77 N, 7 28 12 W）是建于1997年的奥德莱蒂大坝下游的地区。N.B，点位2至5不构成严格意义上下游地球化学梯度。这些领域的环境参数，如水温和SPM水平始终高于夏季时期。颗粒物水平可能反映由于夏季浮游植物的增加，因为水体深度在冬夏两个采样季节都非常相似。相比之下，除了点位5，在冬季时期PH和溶解氧含量较高。这可能由于水温较低和有机质含量较少。只有点位5，盐浓度大于零（表1）.3.、采样和分析方法31抽样采样
13、过程中覆盖两个季节，2005年夏季和2006年的冬天。这样提供了可进行比对的书流量和水体条件，以便分析季节的差异。3.11双壳类在每个季节，从每个位点采集20个双壳类C fluminea并送到实验室。生物体进行清洗泥沙残留，在曝气箱（约20升）净化48小时，以消除其肠道的消化物。净化后，对每个店采集的10个C fluminea进行解剖获得脏器，分别在液氮中冷冻并储存在-80备检。其中的5个用于总铅和ALAD活性测定；5个被用于测定LPO浓度。剩下的10个在-20冷冻48个小时用于铅同位素分析。不巧地是，由于湖边管理，在2006年夏季在点位1没有采集到标本。它们的栖息地被破坏，总共9份样本被收集
14、（夏季五个点和冬季4个点）312水使用1000mL聚乙烯瓶（预先用稀释的盐酸，硝酸清洗24h，并且用去离子水彻底漂洗）在每个点收集双份水样。在样品收集，运输，处理，操作和分析过程都要保持洁净（环保局，1996年。抽样四周为痕量金属在EPA水质标准等级，方法1669.US环境保护代办处，华盛顿1996年，EPA，1996）。收集之后，立即通过0.45微米醋酸纤维素膜过滤器过滤水样，收集悬浮颗粒物质（SPM），在pH2时酸化，并用HCL浓缩，并存储在4直到铅分析。N.B这些水样并不用于铅同位素分析3.2 原位测量 在每个站点，用WTW MultiLine F/SET-3探针直接测量距离河岸和水面1
15、m处水体的温度（），盐度（PUS），pH，和溶解氧（mg/L），相似的方法用于测量不作为采样点的淡水，尽管水浊度这个参数可以从悬浮颗粒物（SPM）比例中得到，结果报告在表1。3.3 分析方法3.3.1 铅，铜和锌的总含量在与硝酸消化后，通过石墨炉原子吸收光谱（PE）测定C fluminea中总金属含量。分析精确度和准确度通常用牡蛎组织标准物质作定期检查（SRM 1566bNIST)。过滤水样中的金属总浓度经氨盐基吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(APDC)和甲基异丁基酮的液提取后，进行石墨炉原子吸收光谱法测定。这个做法为了预浓缩金属，特别是铅，从而降低检测下限。经认证的标准淡水参考物（从NIST的SRM
16、1643d）用于核查在水样中的金属测定的准确性。偏离认证值5%内的被认为是允许的。空白样品中的含量比较与样品中金属含量是可忽略不计的。3.3.2 ALAD活性 ALAD活性测定方法是从血液中ALAD在活性测定欧洲标准方法改良而来（Berlinand Schaller, 1974）。简而言之， C fluminea的整个软组织用0.1M磷酸缓冲液（PH=6.6）匀浆。该组织匀浆经4，10，000rpm离心15分钟后，取上清液，分成五份，每份50L。再将200L磷酸缓冲液加入其中的两份中，再将200L的ALA-试剂（含-氨基酮戊酸）加入到剩下的几份。该混合物室温孵育2小时后，加入750L沉淀试剂（含有三氯醋酸），混合30分钟。然后在2500rpm离心5分钟。将离心后的上清液取500L转移到一个塑料管中（1mL），再与500L的埃尔利希显色剂混合，在2
