第四章 蛋白质（Protein）分析第一节 基础知识一．概述1. 蛋白质——“protein” 由希腊文转 “最原始的” ——蛋白质：主要由20多种a-氨基酸以肽键（peptide bond） 连接而成的（肽链chain）具有确定构像的生物大分子，此外许多蛋白质还会有一些非氨基酸成份，如糖、脂 核苷酸、磷酸、金属离子等辅基（成键），配基（分子间力）2． 性质：•分子量从数千 数百万•是生物体重要组成部分，重量上占细胞干重的一半以上，肌肉、皮肤、血液、毛发重要成份• 功能上参与几乎所有的生命活动过程，酶、运输蛋白、防御蛋白、激素蛋白、毒蛋白、受体 运动蛋白、结构蛋白• 种类 估计 1010-1012种二．结构蛋白质结构异常复杂，分为四级描述(—)—级结构(primary structure)指肽链中的氨基酸排列顺序（序列），也包括二硫键的定位蛋白质结构的基础）1．肽键 peptide bond结构式R1NH —C—COOH + NH —C—COOH 2HT NH —C—C—N—C—COOHdR2羧基氨基肽键不同氨基酸首尾相接般肽键反式结构2． 肽链 peptide chain——由肽键连接而成多氨基酸链——结构式R O / H O' \ R1H/ I m 13NH —C —C —N —C —C —N —C —COOH2 〔 / IH ■■■■.. H R H H2N端残基 残基 C端残基•形成肽键后，氨基酸失水成为“氨基酸残基” residue链中氨基酸单元”•结构式习惯写法N 端在左C 端在右二肽三肽多肽蛋白质3． 多肽 (polypeptide)2 个氨基酸残基 肽链〉〉10－12 氨基酸残基 肽链3 个氨基酸残基 肽链〉数十氨基酸残基 肽链 蛋白质＞多肽4． 二硫键 disulphide bond① 形成NH2H—C—CH SHI 2COOH半胱氨酸 Cysteine (Cys)分子中两SH在碱性pH下,易氧化成硫－硫键(二硫键)结构图—SH + —SH + O t —S —S — + H O② 种类链内二硫键 同一肽链内 Cys 间链间二硫键 不同肽链内Cys间牛胰岛素肽链结构图1953 年，英国 Sanger 测序 5700MW中国 6年9个月 1965 年首先合成结晶胰岛素（二）二级结构 （Secondary structure） 一级结构——线性链式结构 氨基酸链经过一定程度盘绕和折叠，形成二级结构 常见的有：a—螺旋、B—折叠、B—转角 无规则卷曲最常见① 最简单——完全伸展结构② a—螺旋 helical form （链内氢键）某残基中- NH与另一残基C=O形成氢键③ 0 -折叠 片结构(pleated sheet structure) 由链间氢键形成并列肽链结构(逆向平行，顺向平行) 形成两条，多条 顺、逆向平行结构一条肽链回折 逆向平行(三) 三级结构(tertiary structure)蛋白质在二级结构基础上，分子进一步盘绕、折叠，形成 三级结构，使分子形成一定外形。
如形成1. 球蛋白 ① globular protein 酶，抗体② 内部疏水性，外部亲水 作用力：链间二硫键，或分子间力疏水作用力2．纤维蛋白 fibrous protein 线性肽链联接成片，束 分子间二硫键a-螺旋弹性蛋白 分子间力0－折叠 弹性较差 三级结构是蛋白质功能和活性的结构基础 ——如酶、抗体的活性中心（四）四级结构 （quaternary structure）1. 可以认为一些具有特定三级结构肽链（亚基）通过非化学键形成的大分子体系 ――多链空间布局2 •每个具有三级结构的肽链单元--亚基，多无活性3 •结合蛋白--结合一些非蛋白组分--辅基配基4.也有蛋白仅有一个肽链，结构仅到三级结构为止四） 结构性质1．一级结构（化学键）是基础——高级结构取决于一级结构？ ——不同一级结构，高级结构不同；——同一级结构，高级结构同？2. 二、三、四--高级结构——决定外形，内部结构，——蛋白活性，功能，直接关系，一级结构 共价键3. 蛋白质高级结构，具有稳定性，可变性稳定性--非共价键分子间作用力，氢键，离子键疏水性，范德华力等， 1/90 共价键可变性――活性改变，——化学反应 ——易变性：热，紫外线，酸碱，表面活性剂，重金属，有机溶剂，剧烈搅拌--物理变化三．性质1.两性电解质R O H O R11I I II 13H R2残基NH —C —C —N —C —C —N —C —COOH 2N 端残基C 端残基H酸碱活性基团：——亚胺基 pH=0-14 无明显酸碱性质——N端残基-NH22——C 端残基 -COOHRl、R2、R3——COOH:谷氨酸-CH CH COOH Glu22天冬氨酸-CH COOH Asp2R1、 R2、 R3——NH: 赖氨酸 -CHCHCHCHNH(Lys)2 2 2 2 2 2精氨酸-CH CH CH C(NH)NH (Arg)2 2 2 2组氨酸(His)---CH ---C====CH2NH N"w7——等电点 pI在某-pH，蛋白分子表观电荷为0,不同蛋白质，等电点不同，蛋白分离的重要依据2. 大分子性质①分子量 数千――数百万， 达千万 分子大小，如3.4万MW—球状4・3nm, 胶体 1-100nm，蛋白质亲水基在外，带电荷，亲水胶体 表面水化层与电荷使其不致凝集②性质•扩散速度慢，可以用离心分离•粘度大• 不能透过半透膜，可利用渗析分离3. 变性①蛋白质空间构象（二、三、四级结构）破坏——不发生肽链的断裂――理、化、生性质改变=变性分类：――可逆变性――不可逆变性③ 影响变性的因素• 紫外线• 加热，，变性，凝固，如煮鸡蛋• 电解质，强酸，牛奶凝结，三氯乙酸，血浆蛋白沉淀强碱， 盐：rm ■NaCl (NH ) SO NaSO 盐析沉淀4 2 4 2 4如豆腐，用于血浆蛋白分离通常不变性，重金属盐：Hg Pb Cu Ag通常变性 解毒•有机溶剂：酒精，甲醇，丙酮，沉淀、变性如：酒精消毒变性， 沉淀， 凝固• 变性不一定沉淀或凝固• 沉淀不一定变性• 凝固肯定变性，沉淀第二节 定量分析方法定量前，经过一定的分离净化，纯化蛋白过程 一．光谱法 见 P387 （一）紫外吸收光谱法1. 原理：AAs 中含芳环：苯丙氨酸 Phenylalanine (Phe)—CH — 2Tryptophan(TygzTrp)色氨酸NH-CH2-〈O〉0H酪氨酸Tyrosine (Tyr)苯丙氨酸，Xmax—257nm酪氨酸，Xmax—280nm色氨酸， Xmax—280nm有苯环分子结构 280nm附近有吸收末端吸收 220nm 肽键，但有很多物质在此有吸收蛋白质通常在280nm有最大吸收峰，核酸有干扰 260nm2. 方法：(1) 标准对照法，需标准品(2) 吸收系数法，――粗测法，1cm比色池A =1 C=1mg/ml,280不同蛋白 C=1mg/ml A = 0.7-2.4 C(mg/ml)=1 ・45A -0.74A280 260 C(mg/ml)=1 ・55A -0.76A280 2603・ 特点：粗测定量，不同蛋白 phe tyr trp 含量不同 有标准品较准，抗干扰能力弱对蛋白无破坏，常用于柱色谱中洗脱峰的测定（二）荧光光谱法苯丙氨酸，Xex—257nm 酪氨酸，Xex—280nm 色氨酸，Aex—280nm 蛋白质 Xex—280nm九em—280nm 强度一弱九em—303nm 强度一强九em—348nm 强度一强九em—340-350nm二．化学法1•凯氏定氮法(kjeldehl method )测有机物含氮量经典方法① 原理：蛋白质中含氮量14-16%，见书表P388② 方法：―一消化：蛋白质+浓H2S0广(nh>so4几个小时2 4 4 2 4―一蒸馏：(NH4) 2SO4+NaOH — -NH3—硼酸标准溶液吸收4 2 4 3水蒸气蒸馏 滴定：酸碱滴定③ 特点：操作繁琐，测定较准确，常量分析总氮含量，干扰核酸、脂类、生物碱、卟啉2•双缩脲法(Biuret met hod)名不附实？① 原理：P390蛋白质肽键- C0-NH-，在碱性溶液中Cu2+络合一蓝色产物545nm测，蛋白+试剂- 30min② 特点：不同蛋白差异小，可靠。
灵敏度低， 1mg/ml4. 福林一酚法（Lowry method）原理：①蛋白-酮复合物fFolin试剂（磷钼酸-磷钨酸盐），--钼兰和钨兰复合物（深蓝）750nm 测 A 600nm （800nm）有吸收 750nm酪氯酸 色氨酸有一定贡献机理尚未全清②特点：使用众多，灵敏度高，20 m g/ml5. 染料结合方法——应用最为广泛，利用染料与蛋白质结合 ——染料种类：甲基橙、考马斯亮兰、溴甲酚绿等 常用：（Coomassie brilliant blue, CBB 考马斯亮兰G250） P394 电泳染色方法，染料与蛋白结合，最大吸收波长改变，吸光度增大： 464—595nm 快速 （2-5分钟），灵敏（5“g/ml）,常用三．免疫法已讲过第三节 蛋白质分离方法以上介绍，测总量蛋白方法，未有分离，如测单一结构蛋白 必须分离一．电泳分离1．支持介质①分类： ——纸，醋酸纤维素膜 ——淀粉、琼脂糖、聚丙烯酰胺，凝胶（常用）， 孔大， 最常用②聚丙烯酰胺，凝胶（Polyacrylamide gel） PAGE, 丙稀酰胺（剧毒） +甲叉双丙稀酰胺――共聚合――凝胶 激发 多孔网状 四甲基乙二胺 过硫酸铵，孔径大小--聚合条件，单体浓度决定孔径大小 分子筛效应（molecular sieving effect）分子量（大小）有关，分子小 走的快2．电泳装置圆盘（柱），垂直 水平（用的最多）3. 常规聚丙烯酰胺凝胶电泳 PAGE① 原理：（1） 蛋白质侧链谷天，赖组精，不同 PH ，不同电荷， 不同蛋白质，——同一 pH 带电荷不同，等电点不同（电荷不同）—分子量不同，分子大小不同—（分子量不同） 常规聚丙烯酰胺凝胶电泳分离原理：——电泳效应：电荷大小差异——分子筛效应：分子大小差异质荷比（2） 特点：样品电泳后不变性（3） 关键：•缓冲液选择：——pH 8.0-9.5——离子强度 10-100mM/L• 凝胶选择：孔径，梯度②方法：——制胶——电泳 1-2-4 小时——检测：染色（考马斯亮兰）脱色，扫描，照相，转移4． SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳（十二烷基硫酸钠 SDS-PAGE） ① 原理：在样品介质和聚丙烯酰胺PAG加入表面活性剂- SDS 强还原剂－硫酸乙醇SDS-。