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1、MTT实验1MTT 溶液的配制 通常MTT 配成的终浓度为5mg/ml,须用PBS或生理盐水做溶剂。市面上一般MTT的包装为100mg,250mg或1g。1.1对于100mg这样的小包装，厂家都是将MTT放入小管中的，个人建议不要再用天平称量分装，而应该一次性将其全配制成溶液，如100mg用20mlPBS来溶解。 具休做法：预先在50ml离心管加入20ml PBS，从中先吸取500-1000ul PBS装入含MTT的小管中，吹打若干次后将其移入50ml离心管，然后再混匀。可以重复几次，以使小管中的MTT不残留于管内。将MTT完全混匀后，用0.22m滤膜过滤以除去溶液里的细菌，分装避光(避光袋或
2、是黑纸、锡箔纸包住)可长期保存于-20度。按细胞培养板每孔需加10ul计算，一般每96孔板约需1ml，所以分装时可考虑每管分装1ml。1.2对于大包装，可按上述方法称取一部分溶解，也有人将粉剂分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加。注意事项：l在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感。MTT一般最好现用现配，过滤后4度避光保存两周内（个人曾做过4度避光保存4周的MTT溶液，效果仍然不错）有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用。M
3、TT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套. 2MTT甲瓒溶解液2.1二甲基亚砜DMSO，可以直接溶解，无需配制，使用方便，溶解速度快，但对人体毒性较大，且需去除原培养液，在去除培养液的过程中，可能会把结晶去掉，导致结果不稳定。MTT法实验步骤1: 胰酶消化对数期细胞，终止后离心收集，制成细胞悬液，细胞计数调整其浓度至5-10104/ml。 细胞数量因实验目的不同应做相应调整，如一般细胞增殖实验每孔2000个就可以（相当于细胞悬液密度为2104/ml），细胞毒性实验每孔500010000个（相当于细胞悬液密度为5104/ml）。此外，还应根据细胞本身特性，如生长快慢，来决定细胞
4、数量。比如：生长较快的细胞密度可略小。2将细胞悬液制备好后，轻轻混匀，每孔加入100ul, 这样待测细胞的密度为500010000/孔（边缘孔用无菌PBS填充）。注意：因细胞在混匀后仍要继续沉降，因此接种的过程中要反复多次混匀，如每加6个孔就混匀一次，以确保接种的细胞密度在各孔之间完全相同，这对于MTT的结果至关重要。3.将接种好的细胞培养板放入培养箱中培养，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设6个，否则难以反应真实情况。下图可做
5、为96孔板的的参考步局。对于加药，有人直接将药物按不同体积加入到96孔板中，以形成浓度梯度。但本人认为应尽量在EP管中将不同浓度的药物配好，然后将96孔板中的培养上清去掉（可以用排枪吸走）再加入100ul含不同浓度药物的培养基，这样能保证药物浓度的准确。另外，需注意的是，如果用这种方法，不要把96孔板的培养液全部吸走后再加药，应该吸完一部分后立即加样，避免由于96孔板干燥引起细胞死亡。4. 5%CO2，37孵育16-48小时，倒置显微镜下观察药物的作用效果。下图为一典型的药物梯度为细胞的毒性作用。5.每孔加入10ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。若药物与MTT能够
6、反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。 6. 终止培养，准备溶解结晶，用DMSO溶解1) MTT加入培养4h后，结晶可充分形成。将上清去掉，该过程要注意不能把Formazan结晶移走。有人直接用移液器将上清移走，也有人建议先铺几张滤纸在桌面，然后将96孔板轻轻倒置，这样上清便被滤纸吸走，以减少结果的损失。个人认为，这两种方法都有可能导致结晶的损失，从而引起结果的不准确。采用哪种方法，可以自己摸索一下再决定。2) 每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。个人曾经摸索，加入
7、溶解液后过夜再测对OD值基本无影响，但要注意的是一定要避光，不过培养箱关闭后本身就是闭光的，所以加入溶解液后放入培养箱中，第二天上班时再测OD值就可以了。7、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）。六、MTT结果分析 关于如何计算IC50 1、改良寇式法:lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4) Xm:lg 最大剂量 I:lg(最大剂量/相临剂量) P:阳性反应率之和 Pm:最大阳性反应率 Pn:最小阳性反应率举个例子：各药物浓度作用于某肿瘤细胞后所得MTT值如下药物浓度ug/ml100502512.56.2
8、53.1250OD均值0.0800.0930.2360.3740.4410.5310.614公式中的最大最小阳性反应率就是最大最小抑制率抑制率=1-加药组OD值/对照组OD值，如对于100ug/ml的药物，其抑制率=1-0.080/0.614=0.869，各组抑制率如下：药物浓度ug/ml100502512.56.253.125抑制率0.8690.8490.6160.3910.2820.135代入计算公式：Pm=0.869Pn=0.135P=0.869+0.849+0.616+0.391+0.282+0.135=3.142Xm=lg100=2lgI=lg100/50=0.301lgIC50=2-0.301*(3.142-(3-0.869-0.135)/4)=1.655 IC50=45.186该药物的IC50值为45.186ug/ml
