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1、摘 要在现代社会，肥胖问题已经成为全球性的一个公共健康疾病，引起了人们越来越多的关注。脂肪的生长涉及多基因表达、多信号途径及网络式调控，过程极其复杂。MicroRNA（miRNA）是一类存在于真核生物体内，大小为1825nt的非编码(non-coding)内源性小分子物质，在多种生物学过程，包括细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡、以及脂肪的生成代谢中发挥重要作用。选用小鼠、大鼠和鸡胚等实验动物来研究脂肪的生成机制，已经为解决肥胖问题提供了一些依据。但是选用矮小型鸡与正常型鸡来作为实验动物对脂肪的生成机制进行研究还未见报道。为了研究这两个品种鸡之间脂肪生成的差别，我们选用7周龄的矮小型鸡和正常型鸡做为
2、实验动物，运用miRNA微阵列技术分析腹脂中miRNA的表达谱,芯片结果显示：miR-10b，miR-148a，miR-199-3p，let-7k在矮小型鸡中表达上调，正常型鸡表达下调，其中miR-10b达到极显著差异(P0.05)；miR-181a-5p，miR-2188在矮小型中表达下调，正常型鸡表达上调，达到显著差异（P0.01）。分析与脂肪生成相关的差异表达的miRNA的功能，能为人类和伴侣动物的肥胖症等能量代谢综合征寻找新的治疗靶标以及调控家畜的脂肪组织发育从而改善肉质提供借鉴和参考。关键词：鸡 miRNA 脂肪The Analysis of miRNA Profiles in Ab
3、dominal Fat of Dwarf Chicken and Normal ChickenXia LiangCollege of Science, South China Agricultural University， Guangzhou 510642，ChinaAbstract：In modern society, obesity has become a global public healthy problem, more and more people pay attention to it. The signaling pathway of fat growth involve
4、d in polygene expression, and network control, the process is extremely complex.MicroRNAs (miRNAs) are a class of small non-coding RNAs (approximately 1825 nucleotides in length), existing in eukaryotic organisms, are involved in the regulatory network of many biological processes and play an import
5、ant role in many processes ,including cell proliferation, cell differentiation, apoptosis, and fat metabolism. Study the generation mechanism of fat with mice, rats and chicken embryos has provided some basis to solve the problem of obesity. But choose dwarf chicken and normal chicken as experimenta
6、l animals to study the mechanism of fat formation has not been reported. To investigate the different of fat formation in two types of chicken,we choose 7- week old dwarf chicken and normal chicken as experimental animals. we have adopted miRNA microarray technology to analyze the expression profile
7、 of miRNA in abdominal fat. The results showed that miR-10b,miR-148a,miR-199-3p,let-7k up-regulated in dwarf chickens, down-regulated in normal chickens, and miR-10b up-regulated extremely significant (p0.01)；miR-181a-5p，miR-2188 down-regulated in dwarf chickens and up-regulated significant in norma
8、l chickens(p0.05). Studying the miRNAs expressed differently and analyzing their function can provide reference for solve the problems of obesity in human and company animals.Key words：chickens miRNA fat 目 录1前言12 材料与方法32.1 实验动物.32.2 主要试剂及仪器32.3 样本的采集32.4 用于microRNA 表达谱分析的样品总RNA制备32.5 芯片检测43 结果与分析43.
9、1 总RNA提取及检测43.2 miRNA 检测芯片图53.3 miRNA检出率63.4 矮小型鸡与正常型鸡腹脂miRNA表达谱73.5 矮小型鸡与正常型鸡腹脂miRNA差异表达谱.94 讨论9参 考 文 献11致 谢13I1前言在现代社会，肥胖、型糖尿病问题已经成为了一个公共性的健康疾病，越来越多的引起了人们的关注。它们的病理过程涉及脂类代谢和脂肪形成，深入理解脂肪形成的分子机制，对解决这些疾病的防治问题具有重要意义。 一直以来，脂肪组织被认为是带有一些优良特性且能储存能量的惰性组织，例如它可做为绝缘物质以及机械性地支撑更重要的结构。1994年瘦素的发现，预示着人们逐渐意识到脂肪细胞是整个身
10、体能量平衡的必要调节剂。这些细胞分泌一些蛋白，它们的调节过程因体内平衡血压免疫功能血管形成以及能量平衡状态的不同而不同(Tong, 2001; Farmer, 2006; Rosen, 2006)。脂肪细胞来源于多能间充质干细胞。脂肪生成为两个阶段。第一是定型，这是分化特征出现前确定分化方向的过程，多功能间充质干细胞分化成前体脂肪细胞，失去了向其他方向细胞分化的能力，但是在形态学上与先前细胞不能区分开；第二是终端分化，细胞具有了成熟脂肪细胞的特性：脂质的转移和合成，对胰岛素的敏感性以及脂肪细胞特殊蛋白的分泌。MicroRNA(miRNA)是一类大小约1825nt的内源性非编码小RNA分子，具有
11、高度保守性，其本身不具有开放阅读框(open Reading Frame, ORF)，是一组不编码蛋白质的短序列RNA，是一种广泛存在的对基因表达进行调控的分子。miRNA广泛存在于真核生物中，其序列和功能在不同物种间非常保守。1993年, Lee等（1993）在秀丽新小杆线虫(caenorhabditis elegan)中发现了第一个定时调控胚胎后期发育的基因lin-4。此后,研究者又在线虫C.elegan中发现第二个异时性开关基因let-7。2001年10月 Science报道了研究者从线虫、果蝇和人体克隆的几十个类似C.elegan的lin-4 的小RNA基因,称为microRNA（mi
12、RNA）。随后多个研究小组在包括动物、果蝇、植物、病毒等多种生物物种中鉴别出上千个miRNAs。从MicroRNAs被发现至今，人们对MicroRNAs研究的热情一直剧增。人们发现MicroRNAs在许多生物过程中都具有调节作用，包括调节发育、细胞增殖、分化，凋亡以及脂肪细胞分化。研究表明，miRNA不但调控动物脂肪细胞的分化， 还参与脂类代谢及与脂类代谢相关的激素内分泌调节，有的甚至与肥胖、型糖尿病等脂类代谢病的基本病理相关（Poy M N，2007；Takanabe R，2008）。Esau C等（2006）研究发现miR -122直接调节体内脂类代谢，将miR -122 的反义寡核苷酸投
13、予小鼠可增加肝脏脂肪酸氧化作用，同时降低脂肪酸合成；删除miR -14 导致动物甘油三酯和甘油二酯水平增加（Xu P，2003）；这些研究事实表明， 通过miRNAs 功能的研究，可以加深对脂肪形成和脂类代谢性疾病的病理生理过程的分子机制了解，并将miRNAs 作为这些代谢性疾病治疗的潜在靶点。目前，虽然对miRNAs 调节动物脂肪细胞分化和脂类代谢的了解还不多，但miRNAs 自身的调节特点及其潜在应用价值，使其必将成为未来几年该领域的研究热点。并且，miRNA作为小调控RNA,研究其对脂肪细胞分化的调节作用,可以从一个新的角度了解脂肪组织的生长发育机理。本研究以7周龄GHR缺失型矮小型鸡为
14、研究对象，以正常型鸡为参照，采用微阵列基因芯片技术检测矮小型鸡（dw-）和正常型鸡（normal）腹脂中的miRNA表达情况，分析miRNA的表达谱，找出差异表达的miRNA,为进一步筛选出与脂肪生成相关的miRNA,并探讨其在脂肪生成过程中的作用机制提供依据。2 材料与方法2.1 实验动物实验动物来自于南海种禽有限公司。2个品种均为隐性白羽洛克鸡。其中一个以隐性白羽洛克鸡为基础，通过导入矮小型基因（dw）并经多个世代的选育，形成了遗传性能稳定的矮小型隐性白羽洛克鸡，简称矮小型鸡（Dwarf chicken）；另一个为体型正常的隐性白羽洛克鸡，简称正常型鸡（Normal chicken）。2.
15、2 主要试剂及仪器固相RNA酶清除剂购于天根有限公司；北京六一电泳仪DYY-CC型；苏州SW-CJ-1 Cu型双人单面净化工作台；2.3 样本的采集随机抽取按常规饲养方法饲养至7周龄的矮小型鸡和正常型鸡各9只，用经DEPC水处理过的器械分离出腹脂，分别装入冻存管中，迅速置于液氮（-196）中保存；2.4 用于microRNA 表达谱分析的样品总RNA制备矮小型鸡与正常型鸡腹脂的总RNA的抽提按照常规的Trizol提取方法进行。总RNA的提取采用Invitrogen 公司的TRIZOL Reagent 进行。所接触的所有器械都预先用RNA酶固相清除剂进行处理。（1）将50100mg组织用液氮研磨成粉末状后，加入1ml TRIZOL Reagent 匀浆，室温静置5min，转入1.5ml 离心管中，4 12000g 离心10min,收集上清至新的离心管中；（2）RNA的分离：加入0.2ml氯仿，剧烈震荡混匀，静置15min至分层明显，4 12000g 离心15min，离心后分成3层，上层为无色水层，中间为白色蛋白层，下层为红色有机层，RNA主要在上层无色水相中；（3）RNA的沉淀：小心吸取上清新的EP管中，注意不要将中间层和有机层吸入管中，加入同等体积冰上预冷的异丙醇，轻轻颠倒混
