玉米抗甘蔗花叶病毒病主效QTL的克隆与抗病机理研究

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1、玉米抗甘蔗花叶病毒病主效QTL的克隆与抗病机理研究玉米甘蔗花叶病毒病是由甘蔗花叶病毒(Sugarcan moraic virus,SCMV) 引起的病毒病害 , 对全球玉米生产安全造成严重危害。长期以来对此病的化学防治效果不明显 , 培育及推广优良玉米抗病品种是防治此病的有效措施。遗传研究表明 , 玉米抗甘蔗花叶病毒病涉及两个主效QTLs(Quantitativetraitloci),Scmv1和 Scmv2,分别位于第 6 和第 3 号染色体上。 其中 Scwv1在抗病早期发挥作用 , 而 Scmv2在抗病后期显现功效。本课题组前期利用Scmv2位点固定 Scmv1位点分离的 F2 群体对

2、Scwv1进行了连续的精细定位 , 将其限定在分子标记R1-2 和 IDP11 之间 , 物理距离为112.39kb 。本论文针对玉米抗甘蔗花叶病毒病主效QTL-Scmv1,开展精细定位、抗病基因克隆、抗病基因功能分析与抗病机理等研究, 主要结果如下 :1. 在前期定位结果的基础上 , 利用发展自郑 58( 感病 ) 昌 7-2( 抗病 ) 和黄 C(高感 ) X178(高抗 ) 的两个 RILs(Recombinant inbred lines)群体对 Scmv1候选区段进行验证并筛选重组 RILs, 将 Scmv1区段缩短至分子标记579P4和 SNP3之间 , 物理距离为59.21kb

3、。2. 利用 Scmv1定位区段内的分子标记分别筛选玉米抗病自交系FAP1360A、1145 和黄早四的 BAC(Bacterial artificial chromosome)文库 , 构建覆盖 Scmv1的 BAC重叠群。筛选最少重叠 BAC克隆进行测序与基因注释 , 发现 3 个可能参与抗病反应的基因 , 分别为 ZmTrxh、 ZmCAS和 ZmSUS。结合基因表达分析 , 确定 ZmTrxh为抗病候选基因。 3. 从 1145 BAC克隆(ZM579B1)中亚克隆完整 ZmTrxh基因片段由农杆菌介导转化受体HiII(高感 ), 获得转基因植株 (T2,T3 和 T1F1)转基因结果

4、显示 ,ZmTrxr 能显著提高玉米在早期对SCMV的抗性 , 两个主效位点抗病基因均存在的转基因植株对SCMV表现完全抗性。4.ZmTrxh 在抗感材料中基因编码区无多态性, 启动子区域距 ATG上游1.184kb 为保守区段 , 其余部分差异显著。 ZmTrxh 表达水平与植株抗性表现密切相关。5.ZwTrxh 在成熟叶片中表达水平最高。ZwTrxh 能够响应 SCMV诱导表达 , 在接种 24h 后达到表达高峰。在玉米原生质体瞬时表达体系中过表达ZmTrxh,可以抑制 SCMV的复制。6.ZmTrxh 编码非典型的 H-型硫氧还蛋白 , 分布于细胞质中。抗病蛋白 ZmTrxh 活性位点处

5、的两个半胱氨酸被天冬酰胺和丝氨酸替代(WNPQS),但仍可正常折叠形成典型的Trx fold三维结构。 ZmTrxh蛋白活性位点的变化在玉米基因组中唯一存在, 使其与其余典型的硫氧还蛋白相区别。蛋白活性测定表明ZmTrxh丧失氧化还原功能 , 但具有分子伴侣功能。 7. 以ZmTrxh作为诱饵蛋白筛选抗病自交系FAP1360A的酵母双杂文库 , 鉴定出两个互作蛋白 ZmRbcS(Maize ribulose-1,5-bisphosphatecarboxylase/oxygenasesmall subunit)和 ZmRbcL(Maize ribulose-1,5-bisphosphatecarboxylase/oxygenase large subunit)。在 SCMV 编码的 11 个蛋白中 ,P3 和 CP蛋白与寄主蛋白 ZmRbcS和 ZmRbcL互作。抗病蛋白 ZmTrxh与 SCMV编码的 P3,CP,6K1,6K2,VPg 和 P3-PIPO 均存在互作。综合实验结果表明 ,ZmTrxh 是玉米长期与病毒的抵抗反应中特异分化出来的抗病蛋白 , 编码非典型的氧化还原蛋白, 利用自身分子伴侣的功能, 通过保护寄主蛋白免受病毒蛋白袭击以及削弱病毒蛋白功能, 从而抑制 SCMV的复制 , 提高病毒对 SCMV的抗性。