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1、His标签重组蛋白大量表达及纯化一 筛选及鉴定 1 将构建好的连接产物进行转化DH5 鉴定表达载体和目的片段的连接一般为10L连接体系，此步转化方法如下： 取100L DH5感受态细胞，加入到10L连接产物体系中冰上放置30min42准确热激90秒冰上放置3min加入300L无Amp+ 的LB培养基，37 100rpm/min振荡培养1h将400L菌液全部涂LB平板（含Amp+）水平放置30 min待菌液完全吸收后，在37温箱中倒置培养过夜（1216 h），直至出现单菌落。2 阳性克隆的PCR鉴定方法如下 挑取单菌落于200L含Amp+LB培养基中（用2.0的离心管），摇床200rpm/min
2、，37培养4h，待菌液浑浊后，取1L做菌液PCR鉴定。PCR扩增体系如下： 取1 L菌液作为模板反应体系如下：模板1 L10PCR反应缓冲液（含Mg2+ ）2 LdNTP(2.5 mmol/L/each)1.6 L上游引物（10 mol/L）1 L下游引物（10 mol/L）1 LTaq酶（5 U/L）0.3 LddH2O 13.1LTotal20 L条件：94预变性 10min94变性 45s50退火 45s72延伸 1min，30个循环的扩增反应 72延伸 10 min4 1% 琼脂糖凝胶电泳检测：电泳上样时：Marker DL2000上样3L 样品（1L loadingbuffer +6
3、L PCR产物混匀上样）100V，20min；紫外透射仪检测，出现目的带的对应菌落为阳性克隆。（注意：记得保存菌种）3 阳性克隆质粒抽提 取阳性克隆菌液200L，加3ml含Amp+ LB液体培养基，37 200rpm/min培养3-4h，待菌液浑浊后，进行质粒抽提。质粒抽提方法如下：取1.5mL菌液于1.5mL离心管中12000rpm离心30s，弃上清加800L STE悬浮沉淀12000rpm离心30s，弃上清重复STE漂洗沉淀的过程加入100L预冷的solution ，强烈振荡混匀温和加入200L solution （solution 现用现配），盖紧管口快速颠倒5次，放置冰上2 min至溶
4、液清亮而粘稠极温和加入150L预冷的solution ，倒置温和振荡10s，冰上放置5 min12000rpm离心5 min取上清（400L），加入等量的酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），振荡混匀12000rpm离心5 min取上清（350L），加入1/10体积（35L）的NaAc（3M）和2倍体积预冷的无水乙醇（700L）上下颠倒5次，（无水乙醇在-20保存）室温放置20min（-20沉淀效果更好）13000rpm离心10 min弃上清（小心倒出），用1ml 70%的乙醇贴壁冲洗漂洗沉淀13000rpm离心10min室温放置让乙醇挥发干净用20lTE溶解质粒DNA，每20L体系中加入1L
5、1mg/mL的Rnase，37作用30min，1%琼脂糖电泳定量检测纯度所用试剂：1、 STE：0.1mol/L NaCL 10mmol/L Tris-HCL(pH8.0) 1mmolol/L EDTA2、 solution ：50mmolol/L Glucose 25mmolol/L Tris-HCL（pH8.0） 10mmolol/L EDTA(pH8.0)3、 solution ： 0.2mol/L NaOH 1%SDS4、solution ：5mol/L KAc 60mL 冰醋酸 11.5mL 无菌水 28.5mL (最终K+的浓度为3mol/L，Ac-的浓度为5mol/L)4 BL2
6、1的转化及诱导表达质粒转化BL21感受态细胞方法如下： 取100L BL21感受态细胞，加入1L质粒冰上放置30min42准确热激90秒冰上放置3min加入900L无Amp+ 的LB液体培养基，37 100rpm/min振荡培养1h取100L菌液全部涂LB平板（含Amp+）水平放置30 min待菌液完全吸收后，在37温箱中倒置培养过夜（1216 h），直至出现单菌落。5 目的蛋白的诱导表达挑取单克隆菌落于3ml的LB液体培养基（含Amp+）中180rpm/min，37培养。待菌液浓度OD6000.6时开始诱导：1. 首先取出50L菌液留样2. 1:1000向剩余菌液中加0.8M的IPTG 3L
7、3. 30 180rpm/min 诱导4h收菌6 目的蛋白SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定1. 取700L菌液13000 rpm离心1min，弃上清2. 空菌对照及marker3. 加30L PBS和30L 2SDS上样缓冲液，用枪吹匀4. 沸水煮10min，稍离心，将液体汇聚管底，取10L上样12%的胶 浓缩胶90V 10min 分离胶160V 50min 考马斯亮蓝染色 30min 脱色液脱色二 大量诱导表达1取300L菌液，加入到50mL LB液体培养基（含Amp+）中 180 rpm/min 37过夜2将50ml菌液全部加入到500ml LB液体培养基（含Amp+）中 200 rpm/mi
8、n，37，大约2h左右，此时OD600约等于0.6开始诱导3. 1:1000向剩余菌液中加0.8M的IPTG 550L诱导条件：30 180rpm/min 诱导时间：4h收菌（取700L留样电泳分析，是否表达出来及表达位置和表达量）三 细胞裂解1. 将550ml菌液，收菌前准确称出瓶中（为计算湿菌重量）2. 分三次，4800 rpm/min离心20min，在用PBS洗涤一次，倒置用滤纸控干3. 称全重，计算出湿菌重量4. 每克湿菌加5ml Lysis buffer（Tris：50mM Nacl：300mM PH:8.0）混匀转移到50ml管内5. 每毫升菌液加1:500加0.1M PMSF6.
9、 加入终浓度为1mg/ml的溶菌酶E，玻棒搅动20min7. -80 反复冻融3-5次（冰水混合物中融化）8. 每克湿菌加4mg脱氧胆酸（脱氧胆酸先用1ml Lysis buffer溶解），取样30L准备电泳分析（玻璃棒37水浴中搅拌30min，此步骤若是不可溶性蛋白可这样处理，若是可容性蛋白可在冰水混合物中搅拌）9. 用注射器在冰水混合物中反复吹吸，使菌液不再成团，变得更加粘稠10. 超声20min（每次超声不得超过30s）11. 加终浓度5g/ml的DNase 和RNase A及终浓度10mM 的CaCl2和MgCl212. 室温摇床作用30min，注射器反复吹吸13. 补加一倍体积的Ly
10、sis Buffer，同时加终浓度为1%的曲拉通。（平时常温曲拉通储存液浓度为20%，否则不宜溶解）14. 反复吹吸15. 13000rpm/min 20min16. 上清补加PMSF(1:500) 沉淀用bufferB 溶解同样补加PMSF(1:500)Buffer B： NaH2PO4 20mM Nacl 500 mM Urea 8M PH:8.0Buffer C: NaH2PO4 20mM Nacl 500 mM Urea 8M PH:6.8（不含咪唑，咪唑现用现加，终浓度10 mM）咪唑2M（2M咪唑分装-20保存）Buffer D： NaH2PO4 20mM Nacl 500 mM
11、Urea 8M PH:8.0(咪唑终浓度100mM)分析：上清及沉淀还有样品处理前的留样，进行电泳分析鉴定目的蛋白是可溶的还是不可溶的以便选择纯化方式四 His标签蛋白纯化（可溶和不可溶性）可溶性蛋白纯化（上样前要将上清过0.22m的滤膜）1） wash buffer 平衡柱子（不含咪唑）流速1ml/minwash buffer：NaH2PO4 50mM Nacl 300 mM PH:6.8 过滤0.22m除气2） 上样 流速0.3ml/min（注意蛋白浓度不宜过高，蛋白总量不得超过柱子载量）接一次流穿液，（取样电泳）流穿液也再过一次柱子，接二次流穿液，留样电泳一般可溶性蛋白：过一次柱子就可以
12、将目的蛋白完全吸附，这与柱子有一定关系，第一次操作，最好将一次流穿液再过一便柱子。3） wash buffer（含20mM咪唑）洗脱杂蛋白 0.8ml/min，洗脱至少100ml，直到蛋白吸收曲线变平为止（取30L 电泳分析）4） Elution buffer 洗脱目的蛋白（含250mM咪唑）Elution buffer：NaH2PO4 50mM Nacl 300 mM PH:8.0过滤0.22m除气流速0.3ml/min 收集蛋白 收集峰值 每管2ml 5） wash buffer 平衡柱子（不含咪唑）流速1ml/min6） 保存柱子时用20%酒精，47） 对纯化的样品电泳分析纯度，紫外分光
13、度法定量 蛋白浓度（mg/ml）=1.45OD280-0.74OD260蛋白1:1000分别加入：0.1M PMSF0.5M EDTA 100 PH:7.5（即储存液为100，加入终浓度为1） 5M L-Arginine 100 PH:7.5（即储存液为100，加入终浓度为1）分装-20保存不可溶性蛋白纯化1）沉淀用30ml buffer B溶解后，13000rpm 离心15min 上清过0.22m的滤膜2）Buffer B平衡柱子（不含咪唑）流速1ml/minBuffer B NaH2PO4 20mM；Nacl 500mM；Urea 8M；PH:8.03）上样 流速0.3ml/min（注意蛋白浓度不宜过高，蛋白总量不得超过柱子载量）接一次流穿液，（取样电泳）流穿液重复3-4次过柱子每次的流穿液都要留样电泳分析不可溶性蛋白一般浓度较高，一次不能让柱子充分吸附，所以流穿液重复上样4）Buffer C洗脱杂蛋白，流速0.8ml/min，洗脱至少100ml，直到蛋白吸收曲线变平为止，可用考马斯亮蓝G-250 监测Buffer C NaH2PO4 20mM；Nacl 500 mM；Urea 8M；PH:6.8（含咪唑终浓度10 mM），一般咪唑现用现加，配好的2M咪唑分装-20保存5）Buffer D洗脱目的蛋白（含100mM咪唑）流速0
