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1、农杆菌介导的马铃薯遗传转变系统Steve Millam纲要： 马铃薯是一种全世界性的重要农作物，其块茎作为营养丰富的食品，产量很高。马 铃薯之所以成为大批研究的焦点，是因为它既作为一种主要粮食作物，又能作为所关注的 化合物的潜伏重要根源。转基因技术的发展和应用已经用于马铃薯上，并以此来引进基础 且适用的奇特目标特点。本文描绘了一个迅速、高效和低成本的马铃薯遗传转变系统，与 平时的转变对比，其转变效率可超出 40% 。鉴于核酸印迹法的均匀值计算，证明了每个外 植体切片在转基因上的独立性。 将节间切片与农杆菌一同培养， 而后在卡那霉素的挑选下， 经历一个双阶段的愈伤组织引诱 / 出芽系统。用这类描
2、绘的方法能够获取很高的幼芽重生 率，并且经过 2 次继代培养后，离体茎段从伤口尾端生根，保证有 95% 的外植体被转变 这类转基因状态能够经过分子剖析来证明。马铃薯的块茎生长也促进了大范围的进一步的 研究。1介绍马铃薯是最早用于遗传转变的植物之一。 Ooms 等人在 1986 年用农杆菌浸染马铃薯 Desiree 品种的组织并使组织重生，这成为马铃薯转变的直接凭证。转基因品种 Desiree 和 Bintje 所用的农杆菌由 Stiekma 等人供给。 de Block 报导了一种以叶圆片作为靶组织，且与 基因型没关的转基因方法。 Visser 等人以茎段和叶片为外植体，提出了包含重生和转变在
3、 内的两步法，并作为当前众多已使用的实验方案的基础。各样马铃薯组织相对简单的根系 重生也支持了这些已经报导的马铃薯遗传转变系统。当前很多正在使用的实验方案都报导了一个两步重生法，及先进行愈伤组织引诱，再 进行根系重生。在愈伤组织引诱阶段往常会尽可能防止马铃薯体细胞突变。第一步往常是 加入 1-5mg/L 的玉米素( zeatin )或许玉米素核苷( zeatin riboside )，并联合低浓度的生长 素(往常是的萘乙酸(NAA)或许吲哚乙酸(IAA),以此促进外植体产生愈伤组织。第二 步，将玉米素浓度降低 20% ，将生长素浓度降低 10 倍，同时加入赤霉向来刺激根系重生。每 个外植体的重
4、生速率都很高，经过 4-6 周可生出第一批根，培养 10-12 周后可每个外植 体都会长出起码 10 条根。以卡那霉素( kanamycin )或许潮霉素( hygromycin )作为挑选标 志能够很简单地用肉眼进行剖析，而后切除可能与转变没关的根。那些含有抗生素抗性 基因的苗将会很显然从茎的切口处长出根，而那些非转基因的苗将不会生根或许从不定位点 生根。使用不一样的种植品种或许组织，其转变效率也不一样。可是依据重复实验的记录显 示，从最先的外植体到确立的转基因单株的比率在40%到 100% 之间。只管马铃薯往常是四倍体，但也常常使用双单倍体品系进行转基因研究。别的，野生 的二倍体植株也用此
5、方法进行转变。固然很多的初步报导都鉴于模式植物的研究，但转变 成功的基因型的范围也在不停扩大。在众多马铃薯品种中挑选拥有转变潜力的品种的研究 中，科学家发现了一个存心思的现象，即转变效率与转变潜力没关。近来几年，马铃薯的 研究重心将集中到转基因的发展，包含给予抗病虫害能力，提高块茎质量，以及提高淀粉2 .资料.植物资料马铃薯Desiree品种的试管苗（来自苏格兰农业科学局SASA，网址是或其余机构）保 证最先使用的是脱毒苗。脱毒苗能够选择用马铃薯抽芽的块茎培养的试管苗，或许温室中长势 相同的马铃薯植株。生长调理剂母液提早准备好充分的生长调理剂母液用于配制16 X250mL的完好培养基。母液先用
6、过滤方 式消毒，而后分装到无菌离心管中，并置于-20C中保留，能够保留6个月。1 萘乙酸（NAA）（Duchefa ）:将 20mg NAA 溶解到 ImL IN 的 NaOH 溶液中， 再加蒸馏水定容至20mL，配成lmg/mL的NAA母液。NAA母液可于4 C保留6周。2 赤霉素（GA3）（Duchefa ）:将20mg GA 3溶解到20mL 50%的乙醇（乙醇与蒸馏水的比率为1:1 ）中，配成lmg/mL的GA3母液。GA3母液可于4C保留6周。3米素核苷（ZNR）（Duchefa ）:将20mg ZNR溶解到ImL 1N的NaOH溶液中，再加蒸馏水定容至20mL，配成lmg/mL的Z
7、NR母液。ZNR母液可于-20 C保留6个月。.抗生素母液1 头抱霉素（Claforan， Cefotaxime powder ， Roussel ， Uxbridge， England ）：用蒸馏 水配制125mg/mL头抱母液，并用过滤方式消毒。母液可于-20C保留6个月。2卡那霉素（Duchefa ）：用蒸馏水配制50mg/mL卡那霉素母液，并用过滤方式消毒。 母液可于-20 C保留6个月。3利福平（Sigma ）:用甲醇配制50mg/mL利福平母液，不需要过滤方式消毒。母液 可于-20 C保留6个月。培养基全部的培养基都准备了 250mL，分装至Durand bottles中，并在12
8、1 C下高压蒸汽灭菌20 分钟，同时抗衡生素进行过滤消毒。而后在超净工作台中，先将生长调理剂母液加入培 养基中，再分装至 10 个 9cm 的培养皿中。1.植物生长必需培养基（BM ） : 1 X MS基本培养基加上维生素混淆物（Duchefa product ） , 20g/L蔗糖，用蒸馏水定容至1L，并调理pH至。加 入L的琼脂粉，经高 压蒸汽灭菌后，于4 C保留。2. MS20 培养基：即液体 BM 培养基，成分和上边相同，可是不加琼脂粉。3. 共培养基（CM ）:在BM培养基中加入L的NAA, L的GA3, L的玉米素核苷（ZR ）, 8g/L 的琼脂粉。4. 第一阶段重生培养基（CM
9、C ）:在CM培养基中加入500mg/L的头抱霉素（已用过 滤方式灭菌）。5. 第二阶段重生培养基（CMCK）：在BM培养基中加入L的NAA, L的GA3, 2mg/L 的玉米素核苷（ ZR）, 500mg/L 的头抱霉素（已用过滤方式灭菌） , 50mg/L 的卡那 霉素（已用过滤方式灭菌） 。6. 选择培养基（SM）:在BM培养基中加入500mg/L的头抱霉素（已用过滤方式灭菌）， 50mg/L 的卡那霉素（已用过滤方式灭菌） 。7. LB培养基：10g/L的胰蛋白胨；10g/L的酵母提取物；10g/L的NaCl, pH= ； 18g/L 的琼脂粉。细菌菌株和载体1农杆菌菌株 LBA440
10、4。2DNA建立体：pBIN19的双元载体衍生物。载体经过电击转变进入 LBA4404中。成 功转变的细菌能够选择性地在含有 100mg/L 的卡那霉素和利福平的 LB 培养基上生 长。农杆菌菌液需加入甘油，置于-80 C保留。其余物件和溶液1 灭菌剂：10%的Dmomestos （ Lever Brothers , UK）,其有效成分为%的次氯酸钠。2混淆肥：爱尔兰苔藓腐殖土（ bedding grade ）,1200L ； Pavoir 沙, 100L ；石灰石 （ magnesium ）,；石灰石（ calcium ）,； sincrostart 基肥（ William Sinclair
11、 , Lincoln,UK）,； Celcote 润湿剂（LBS Horticulture , Lancashire , UK）,；珍珠石，100L； Osmocote控释肥（ Scotts ， UK），2kg ；Intercept 杀虫剂（ Bayer ），390g 。3方法培养试管苗全部的试管苗都置于18-22 C, 16小光阴照（光照强度为80-110 uE/m2/s ）, 8小时黑暗 环境下培养。用抽芽的块茎培养试管苗1 将块茎上的芽切下,并用自来水冲刷。2先将切下的芽置于加有2 滴吐温 20 的 70%乙醇中浸泡 1 分钟,而后用 10%的 Domestos 浸泡 15 分钟,再用无
12、菌水冲洗 5 遍,最后放在 BM 培养基中培养。3用装有 BM 培养基的 90mm 培养皿或许组培瓶对茎段和芽尖进行继代培养。用温室中正在生长的植株培养试管苗1 选择生长旺盛,且未遇到病虫害侵袭的植株,将其茎段和芽尖剪下,并立刻用自来 水冲刷。2先将茎段和芽尖剪成 5至 10mm 的小段,而后用加有 2 滴吐温 20 的 70%乙醇漂洗 1 分钟,接着用 10% 的 Domestos 浸泡 15 分钟,再用无菌水冲洗 5 遍,最后放在 BM 培养基中培养。3用装有 BM 培养基的 90mm 培养皿或许组培瓶对茎段和芽尖进行继代培养。准备农杆菌1 从用甘油保留的菌液或许含有 100mg/L卡那霉
13、素和利福平的LB平板培养基上挑取 菌种,并置于 5mL 发酵培养基中活化。2将农杆菌加入5mL含有100mg/L卡那霉素和利福平的 LB培养基中，而后放在摇床 上, 28C, 200rpm 留宿培养。3 留宿培养后，用250mL的锥形瓶将5mL的菌液转入50mL含有相应抗生素的LB培养基中,用相同的条件留宿培养。4 留宿培养后，丈量农杆菌悬浮液的光密度（OD ）值为600nm。5将菌液加入无菌离心管中，700-1000g离心15分钟，而后用15mLMS20重悬积淀。6同时，用650 UL以前摇的菌液和350卩L甘油混淆，配成1mL菌液，用液氮速冻后， 置于-80 C保留。接种、转变和重生1从生
14、长 3-4 周的马铃薯植株上截取长约 10mm ，切面直径不低于的 节间部分。2将外植体（数目不低于 30 个）放在装有 MS20 培养基的平板中，防止干燥。3在 90mm 平板培养皿中加入 15mLMS20 培养基，再加入 1mL 以前摇的菌液，而后 将外植体放入培养皿中，用封口膜密封，置于细菌恒温摇床中，22C, 50rpm转变45 分钟。4将农杆菌悬浮液倒入容器中,并使农杆菌失活。5用无菌滤纸将外植体表面的水分吸干,而后置于 CM 培养基上（每个平板上放 30 个 外植体）。将平板密封后，在18-22 C，弱光处（光照强度为20 uE/m2/s ）转变 48 小时。6而后将转变好的外植体
15、置于 CMC 培养基长进行共培养,每个平板上的外植体应低 于10个。将平板密封后，在18-22 C,充分光照处（光照强度为80-110卩E/m2/s ）培 养。712天后，将CMC培养基中的外植体转移到CMCK培养基中进行培养。8每14天改换一次新的CMCK培养基。9愈伤组织和丛生芽在4周后出现，而后持续培养。当大概第三次换CMCK培养基时， 当心剪下 5-10mm 左右的丛生芽,而后置于 SM 培养基中。10持续每 14 天转移一次外植体,同时剪下后长出丛生芽,保证每个芽发育成独自的植 株。选择和进一步生长转基因的丛生芽1在 SM 培养基中培养 14 天后,移出存活的苗（即那些仅从芽的伤口处长出根的苗） 剪取 10-15mm 的芽尖,而后放在新的 SM 培养基中进行 2 次挑选。2那些从切口处生根的植株能够以为是已成功转变的。接下来就能够将这些植株放在SM 培养基长进行共培养,最后转移到温室中进行培养。Fig. 1. (A)培养6周后从5mm的Desiree外植体茎段长出的丛生芽。照片的放大倍 数为3倍。(B)将可能转变的芽切下，放在含有50mg/L卡那霉素的MS培养基上培养14天后, 能够看到左侧的小苗长出根，所以推测是阳性植株。而右侧的小苗未生根，所以推 断是未成功转变的植株。照片的放大倍数为3倍。3当根系发育优秀的试管苗长到 4-5 个茎节时，
