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1、一酶和酶工程概论1. 酶工程:将酶或者微生物细胞、动植物细胞、细胞器等在一定的生物反应装置中，利用酶所 具有的生物催化功能，借助工程手段将相应的原料转化成有用物质并应用于社会生活的一门 科学技术。2. 应用领域:食品工业轻工业医药工业酶的应用:用于治疗疾病用于加工和生产一些产品用于 化验和水质监测用于生物工程的其他分支领域二酶学基础1 酶:活细胞产生的一类具有催化功能的生物分子，又称为生物催化剂. 酶的分类:蛋白酶类六大类氧化还原酶类转移酶类3 水解酶类4 裂合酶类5 异构酶类6 连接酶类2 酶系统分类编号 EC 类 . 亚类 . 小类 . 序号3 酶催化作用的特点: 高效性,专一性专一性：一
2、定条件下，一种酶只能催化一种或一类结构 相似的底物进行某种类型反应的特性。按专一性程度可分为以下三类： 绝对专一性：一种酶只能催化一种底物进行一种反应如脲酶催化尿素的分解反应4 不可逆抑制: 抑制剂与酶的活性中心发生了化学反应，或共价地连接到酶分子的必需基团上 阻碍了底物的结合或破坏了酶的催化基团不能用透析或稀释的方法除去抑制剂，酶活性难以 恢复。不可逆抑制作用与时间有关5 可逆抑制: 抑制剂与酶蛋白以解离平衡为基础，以非共价方式结合，引起酶活性暂时性丧失 抑制剂可以通过物理方法（如透析等）被除去，并且能部分或全部恢复酶的活性。可逆抑制 作用与时间无关.6 抑制剂与底物的结构相似，能与底物竞争
3、酶的活性中心，从而阻碍酶底物复合物的形成， 使酶的活性降低。这种抑制作用称为竞争性抑制作用。7 非竞争性抑制的特点： 非竞争性抑制剂的化学结构不一定与底物的分子结构类似； 抑制剂与酶的活性中心外的位点结合；抑制剂对酶与底物的结合无影响，故底物浓度的改变对抑制程度无影响抑制程度取决于抑 制剂的浓度动力学参数：Km值不变，Vm值降低。8 反竞争性抑制的特点： 反竞争性抑制剂的化学结构不一定与底物的分子结构类似；抑制剂与底物可同时与酶的不同部位结合；必须有底物存在，抑制剂才能对酶产生抑制作用；抑制程度随底物浓度的增加而增加； 抑制程度取决与抑制剂的浓度及底物的浓度动力学参数： Km 减小， Vm 降
4、低。9 酶活力是指在一定条件下，酶所催化反应的初速度，它是定量表征酶催化能力的指标 第三章酶的生物合成与发酵生产1 应用微生物来开发酶的优点1、微生物种类多，酶种丰富； 2、微生物生长繁殖快，易提取酶，特别是胞外酶； 3、微生 物培养基来源广泛，价格便宜； 4、可采用微电脑等新技术，控制酶发酵生产过程； 5、可利 用以基因工程为主的近代分子生物学技术选育菌种，增加酶的产率和开发新酶种。2、酶发酵生产的类型 1、液体深层发酵：液体培养基，经灭菌、冷却后，接入产酶细胞， 在一定条件下发酵。2、固体培养发酵培养基以麸皮、米糠等为主要原料，经灭菌后，接入产酶菌株，在一定条 件下发酵。 3、固定化细胞发
5、酵（70 年代后期发展）将细胞固定在载体上后，进行发酵生产。4、固定化原生质体发酵（80 年代中期发展）原生质体是指除去了细胞壁的微生物细胞或植 物细胞。3 酶的生物合成模式可发分为4 种类型： （1）同步合成型（2）延续合成型（3）中期合成型（4）滞后合成型4 选择与改造选择：在酶的工业生产中，为了提高酶产率和缩短发酵周期，最理想的合成模 式是延续合成型改造非理想模式：在细胞选育上下功夫，并适当调节工艺条件：（1）同步合 成型：适当降低发酵温度，尽量提高酶所对应的mRNA的稳定性。2）中期合成型要从解除 阻遏和提高mRNA的稳定性两方面进行努力（3）滞后合成型在发酵过程中要尽量减少甚至 解除
6、分解代谢物阻遏，使酶的合成提早开始。四酶的分离与纯化1 酶分离纯化的目标：使酶制剂具有最大的催化活性和最高纯度2 酶破碎方法1）机械破碎 2）物理破碎 3）化学破碎 4）酶解破碎3、酶的分离方法沉淀分离离心分离过滤与膜分离层析分离电泳分离萃取分离4 亲和层习析原理：专一又可逆亲和力的生物分子对：酶与底物酶与竞争性抑制剂酶与辅助因子抗原与抗体酶RNA与互补的RNA分子或片段5 固定相：琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶及聚丙烯酰胺。流动相：含有欲分离物质的混合液 6根据欲分离组分与配基的结合特性,亲和层析分：共价亲和层析疏水层析金属离子亲和层析 免疫亲和层析染料亲和层析凝集素亲和层析7 双水相萃取双水相：高
7、聚物一高聚物聚乙二醇（PEG） /葡聚糖（Dex）；高聚物无机盐PEG/磷酸盐PEG/硫酸铵因两相均含有较多的水，所以称之为双水相8 超临界流体特点：密度接近液体萃取能力强粘度接近气体传质性能好 常用萃取剂极性萃取剂：乙醇、甲醇、水（难）非极性萃取剂：二氧化碳（易） 五酶与细胞的固定化技术1游离酶使用中的局限性1. 稳定性差 2. 提取纯化繁琐,价格昂贵；难以重复使用,成本高3. 产物的分离纯化较困难（酶反应后成为杂质）2 固定化酶优点1增加了酶的稳定性2能降低酶的总体费用3酶的分离和回收变得容易，并 可重复使用4使反应过程的连续操作成为可能5反应产物也易于提取纯化6有利于过程设计 和优化7
8、拓广了酶的应用范围（多酶系统的酶反应，非水相酶反应，生物传感器探头等）3 固定化酶指在一定空间范围内呈闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以 回收重复利用4 固定化细胞（原生质体）指被限制自由移动的细胞，即细胞受到物理化学等因素约束或限 制在一定空间范围内，但细胞仍保留催化活性并具有能被反复或连续使用的活力5 酶的固定化技术（一）吸附法 原理：主要是利用细胞与载体之间的吸引力（范德华力、离子键和氢键），使细胞固定在载 体上，常用的吸附剂有玻璃、陶瓷、硅藻土、多孔塑料、中空纤维等 此外还可利用专一的亲和力来固定细胞优点: 操作简便，条件温和，不会引起酶的变性失活载体廉价易得，且可反复
9、利用 缺点：结合相当弱酶的非特异性吸附常常会引起部分或全部失活每年高浓度盐溶液或底物溶 液可加速蛋白质的脱附。当要求酶的固定绝对牢靠时,采用吸附法是很不可靠的6 包埋法概念：将酶或含酶菌体包埋在各种多空载体中，使酶固定的方法。可分为凝胶包埋 法（网格型）和半透膜包埋法（微囊型）两种优点：一般不需酶的 AA 残基进行结合反应，很少改变酶的高级结构，酶活回收率高 缺点：包埋时发生化学聚合反应，酶易失活，须巧妙设计反应条件。另外网格结构影响底物 和产物的扩散，有时，这种扩散会导致酶动力学行为的改变，所以此法只适合于小分子底物和产物的酶7 交联法8 化学共价法共价法的特点酶和载体的结合比较牢固，酶不易
10、脱落。故使用的半衰期较长制备条件复杂，反应剧烈， 易引起酶蛋白高级结构发生变化制备得到的固定化酶，活力回收一般在50%左右载体不会引起蛋白质的变性，经得起一定的pH,浓度的改变.六酶的分子修饰和改造1 酶化学修饰：指通过各种方法使酶分子结构发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的过 程2酶的化学修饰原因 1稳定性不够，不能适应大量生产条件的需要。2作用的最适条件不符。 3 酶的主要动力学性质的不适应。4 临床应用的特殊要求。3 酶分子定向进化的基本原理酶分子定向进化是从一个或多个已经存在的亲本酶（天然的或 者人为获得的）出发经过基因的突变和重组，构建一个人工突变酶库，通过筛选最终获得预 期的具有
11、某些特性的进化酶。4 定向进化是一个由构建突变体库，突变体表达，表达后筛选三个步骤组成的循环递进过程， 需要：a产生包含大量带有微量有利突变的突变体的文库；b突变体应能在适当的微生物（如 大肠杆菌或酵母菌）体内进行功能的表达；c必须有一种灵敏的筛选方法，能反映出由一个 氨基酸的置换而引起的预期性状的较小提高。第七章酶的非水相催化1溶剂极性参数（IgP）的意义:P表示溶剂在正辛醇/水两相体系中分配系数，通常用其对数 形式表示，即 lgP溶剂的 lgP 值越大，其极性越小，疏水性越强反之，溶剂的 lgP 值越小，其极性越大，疏水 性越低lgP 4，酶具有较高活力，此类溶剂较理想2 lgP 4，酶活
12、力中等选择2 WlgPW 5的有机溶剂作为反应介质最适宜2 有机相中酶催化特性改变（什么原因？） 有机溶剂的存在，改变了疏水相互作用的精细平衡，从而影响到酶的结合部位 有机溶剂改变了底物的存在状态（亲水 / 疏水）影响a底物特异性b立体选择性c区域选择性d化学键选择性e热稳定性、pH特性3 极性较强的有机溶剂中，疏水性较强的底物易反应极性较弱的有机溶剂中，疏水性较弱的 底物易反应.第九章酶反应器1 定义：通常将用于酶进行催化反应的容器及其附属设备称为酶反应器。 作用：使酶得到合理的应用，并能够提高产品的质量和降低成本。2按照结构的不同可以分为：搅拌罐式反应器a填充床式反应器b流化床反应器c鼓泡
13、式反 应器d膜反应器e喷射式反应器3按操作方式分为：a分批式反应b连续式反应c流加分批式反应结构和操作方式结合一起分为：a连续搅拌罐式反应器CSTR b分批搅拌罐式反应器BSTR等4 分批搅拌罐式反应器既可以用于游离酶的催化反应，又可以用于固定化酶的催化反应优点 a设备简单，操作容易，酶与底物b混合均匀，传质阻力较小，反应较为完全，反应条件容 易调节控制。缺点：a用于游离酶，酶难以回收。b 用于固定化酶，反应器利用率较低，而且可能对固定化酶的结构造成破坏。5连续搅拌罐式反应器只适用于固定化酶的催化反应。优点：a设计简单、操作简便b反应 条件容易调节控制底物与固定化酶接触较好c传质阻力较小d反应
14、器的利用率较高。e需注 意控制好搅拌速度，以免由于强烈搅拌所产生的剪切力使固定化酶的结构受到破坏。6 填充床式反应器是将酶固定化后，填充到柱式反应容器中而制成的一种反应器。适用于固定化酶进行催化反应优点：a设备简单操作方便b单位体积反应床的固定化酶密度 大c可以提高酶催化反应的速度缺点：底层固定化酶颗粒所受压力较大，容易引起固定化酶 颗粒的变形或破碎。7流化床反应器。优点：a混合均匀b传质和传热效果好c温度和pH值易于调节控制d不 易堵塞对黏度较大的反应液也可进行催化反应缺点：需要较高的流速才能维持粒子的充分流 态化，而且固定化酶颗粒易于被破坏，流体动力学变化较大，参数复杂，放大较为困难。8鼓
15、泡式反应器。可以用于连续反应，也可用于分批反应。优点结构简单a操作方便剪切力 小 b 物质与热量的传递效率高是有气体参与的酶催化反应中常用的一种反应器9膜反应器分类a平板型b螺旋型c管型d中空纤维型e转盘型 优点：集反应与分离于一体，利于连续化生产。缺点：经过长时间使用，酶或其他杂质 会被吸附在膜上，造成膜透过性降低，而且清洗困难。11喷射式反应器利用高压蒸汽的喷射作用，实现酶与底物的混合，进行高温短时催化反应。 适用于耐高温游离酶的连续催化反应优点：a结构简单体积小混合均匀b可在短时间内完成 催化反应反应器类型流加的操作 方式适用的酶特点搅拌罐 式反应 器分批式 流加分批式 连续式游离酶 固定化酶由反应罐，搅拌器和保温装置组成。设备简单，操作容易，酶与底物混 合较均匀，传质阻力较小，反应比较完全，反应条件容易调节控制。填充床 反应器连续式固定化酶设备简单，操作方便，单位体积反应床的固定化酶密度大，可以提咼酶 催化反应的速度。在工业生产中普遍使用。流化床 反应器分批式 流加分批式 连续式固定化酶流化床反应器具有混合均匀，传质和传热效果好，温度和pH值的调节 控制比较容易，不易堵塞，对粘度较大反应液也可进行催化反应。鼓泡式 反应器分批式 流加分批式 连续式游离酶 固定化酶
