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1、电镜与样品制备技术支持电镜样品取材方法1动物及人体组织的取材动物组织的取材，应在麻醉（1%戊巴比妥钠按5ml/kg体重腹腔注射）或断头急性处死，解剖出所需器官，用解剖剪刀剪取一小块组织，放在干净的纸板上，滴一滴冷却的固定液，用新的、无油污锋利的（双面）刀片将材料切成大约1宽，23长的小块，从中挑选损伤小的小条，再将其切成3的小块，最后用牙签将这些小块逐个放入盛有冷的新鲜固定液的有盖青霉素小瓶里，放入冰箱冷藏室低温固定（）。2体外培养细胞的取材生长在培养瓶中的体外培养细胞取材时，先倒出培养液，接着到入适量的戊二醛固定液，在冰浴上放置min，然后用刮刀轻轻刮下瓶壁上的细胞，将具有细胞的固定液转移到
2、离心管中，普通离心机低速离心（2023转/分钟）15min，使细胞聚成团块，弃去上清夜，换上新鲜固定液继续固定。3 植物组织的取材植物组织的取材比较容易，它的细胞离体后变化不象动物细胞那样迅速，但植物细胞的细胞壁阻碍着固定液的迅速渗透。因此，植物材料的取材宜切成薄片状，经适当固定后再切成小方块。电镜样品取材的基本规定快取材的动作要迅速，最佳在材料离体后min内就进入固定液；解剖器械要锋利，避免牵拉和挤压，尽量减少取材中的机械损伤。准取材要准确。器官要准确部位要准确：如脑垂体的前叶和后叶要分清，其结构和功能各不相同。冷取材过程应尽量在低温下进行（），以减少酶的活性，减少细胞内结构的损失。小所取材
3、料体积要小，一般不超过3。由于固定剂的渗透力较弱，若组织块太大，块的内部将得不到良好的固定。电镜制样中常用固定剂的配制方法缓冲液的配制、磷酸缓冲液（0.2M）的配制方法如下：甲液：Na2HPO4.12H2O 71.64g加蒸馏水溶解成 1000ml乙液：NaH2PO4.2H2O 31.21g加蒸馏水溶解成 1000ml按下表混合甲、乙两液即得所需PH的磷酸缓冲液表1：0.2M的磷酸缓冲液的配制（50ml）PH 6.4 6.6 6.8 7.0 7.2 7.4甲液（ml） 13.3 18.8 24.5 30.5 36.0 40.5乙液（ml） 36.7 31.2 25.5 19.5 14.0 9.
4、5磷酸盐缓冲液对细胞无毒性作用，常用于配制戊二醛固定液，并适于作灌注固定。本缓冲液的缺陷是固定期容易产生沉淀，并容易生长细菌，不能长期储存。B、 二甲胂酸盐缓冲液（0.2M）甲液：二甲胂酸钠 4.28g加蒸馏水至 100ml乙液：0.2N盐酸按表2混合甲、乙两液后，将总体积稀释成200ml即可获得不同PH的缓冲液表2：二甲胂酸钠缓冲液的配制PH 6.4 6.6 6.8 7.0 7.2 7.4甲液（ml） 50 50 50 50 50 50乙液（ml） 18.3 13.3 9.3 6.3 4.2 2.7本缓冲液比较稳定，不易生长细菌，可长期保存，与低浓度的钙质（1-3mM）不发生沉淀反映。缺陷是
5、胂有毒性、有臭味，配制时应在通风橱中进行。 常用固定液的配制A、0.1M磷酸缓冲戊二醛固定液（市售戊二醛多为25%的水溶液）表3：0.1M磷酸缓冲戊二醛的配制戊二醛最终浓度（%） 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 4.0 5.00.2M磷酸缓冲液（ml）50 50 50 50 50 50 5025%戊二醛水溶液（ml）4 6 8 10 12 16 20双蒸水加至（ml） 100 100 100 100 100 100 100B、0.1M二甲胂酸钠缓冲戊二醛固定液表4：0.1M二甲胂酸钠缓冲戊二醛固定液的配制戊二醛最终浓度（%） 1.0 1.5 2.0 2.5 3.00.2M二甲胂酸钠缓冲
6、液（ml） 50 50 50 50 5025%戊二醛水溶液（ml）4 6 8 10 12双蒸水加至（ml） 100 100 100 100 100C、多聚甲醛-戊二醛固定液取2克多聚甲醛粉末溶于25毫升蒸馏水，65下不断搅拌，加1-3滴1N氢氧化钠，使溶液透明，冷却后加5毫升5%戊二醛，加二甲胂酸缓冲液或磷酸缓冲液（0.2M，pH7.2-7.6）使总体积到50毫升，并加25毫克无水氯化钙。混合液的pH为7.2。本液对微管有良好的保存作用。透射电镜的成像原理目前，主流的透射电镜镜筒是电子枪室和由68级成像透镜以及观测室等组成。阴极灯丝在灯丝加热电流作用下发射电子束，该电子束在阳极加速高压的加速下
7、向下高速运动，通过第一聚光镜和第二聚光镜的会聚作用使电子束聚焦在样品上，透过样品的电子束再通过物镜、第一中间镜、第二中间镜和投影镜四级放大后在荧光屏上成像。电镜总的放大倍数是这四级放大透镜各级放大倍数的乘机，因此透射电镜有着更高的放大范围（2001000000）。透射电镜的一般操作流程接通电镜工作电源后，电镜开始通过机械泵抽前级和镜筒真空，当镜筒真空达成一定规定期，再由扩散泵抽镜筒的高真空，当高真空能达成加高压的规定期，面板上高真空指示灯点亮，表白此时可以加高压了，接通高压并调整高压到合适的高压值，稍等一会待高压稳定后，再增长灯丝电流，使荧光屏中心产生一个明亮的光斑，随后依次接通各级透镜的工作
8、电流，调整电镜的工作状态，调整好后再加入样品进行观测，并对感爱好的部位拍照记录。电镜使用完毕，应依次关闭高压、灯丝加热电流、关闭各级透镜工作电流以及取出样品。待冷却水再工作1015min后，关闭电镜和冷却水。电镜在生物医学领域中的应用17世纪光学显微镜的发明，促进了细胞学的发展，20世纪电子显微镜的发明，揭开了病毒和细胞亚显微结构的奥妙。在20世纪60年代以来，电镜广泛应用于工农业生产、材料学、考古学、生物学、组织学、病毒学、病理学和分子生物学等众多研究领域中。但电镜技术从应用的广度、研究的深度等方面看，没有哪一个领域可与生物医学相媲美。1 在细胞学方面：由于超薄切片技术的出现和发展，人类运用
9、电镜对细胞进行了更进一步的研究，观测到了过去无法看清楚的细胞超微结构。例如，用电镜观测到了生物膜的三层结构以及细胞内的各种细胞器的形态学结构等。2 电镜在发现和辨认病毒方面起到了重要作用：许多病毒，特别是肿瘤病毒就是用电镜发现的。电镜也为病毒的分类提供了最直观的依据，例如去年肆虐全球的SARS病毒就是一方面在电镜下观测到并确认是病毒而不是支原体的。3 在临床病理诊断方面：生物体发生疾病都会导致细胞发生形态和功能上的改变，通过对病变区细胞的电镜观测就可认为疾病诊断提供有力依据。例如目前电镜在肾活检、肿瘤诊治中发挥了重要作用。4 电镜技术与生命科学中新兴起的技术相结合，促进了新技术的应用。例如电镜
10、技术与免疫学技术相结合产生了免疫电镜技术，它可以对细胞表面及细胞内部的抗原进行定位，可以了解抗体合成过程中免疫球蛋白的分布情况等。透射电镜在生物医学研究中的重要技术1 常规超薄切片技术一般的透射电镜电子束的穿透能力较弱，大多数标本无法直接在电镜下观测，必须切成厚度为5070nm的超薄片，这种制作超薄片的技术称为超薄切片技术。在透射电镜的生物医学样品制备方法中，超薄切片技术是最基本最常用的制备技术，其他一些样品制备技术，如细胞化学技术，免疫电镜技术及电镜放射自显影技术都离不开超薄切片的制作。运用透射电镜观测超薄切片，可以了解细胞的精细结构。2 负染色技术负染色技术也叫阴性反差染色，它是由Hall
11、等一方面采用的一种染色技术，与超薄切片法相比，该技术具有分辨率高、简朴易行和快速方便等优点。因此在生物学研究中广泛应用。这种方法可以显示大分子、细菌、病毒、原生动物、分离的细胞器及蛋白质晶体等样品的形状、大小和表面结构特性。特别是在病毒学领域，有关病毒的分类及病毒亚单位结构的显示、病毒与抗体的互相作用等的研究中，负染色更是不可缺少的实验技术。3 金属投影与复型技术金属投影技术是运用真空喷镀仪对样品进行投影的一种技术，Williams一方面用这种技术用于增长电镜图象的反差。该技术还可用来测量颗粒及大分子的大小。复型技术重要用于样品表面结构的研究。某些坚硬的材料，如牙齿、骨骼、金属等，它们是不透明
12、的，并且很难制成超薄切片，对于这些材料可用一种电子透明的薄膜将其表面结构复制下来，即成复型。通过对该复型样品的观测，就可以了解原有样品的天然断面或人工断面的结构特性。4 冷冻切片技术和冷冻蚀刻复型技术冷冻切片技术是使样品迅速冷却，然后用冷冻切片机进行冷冻切片，它省去了普通超薄切片中繁杂的化学固定与包埋操作。该技术在细胞化学研究中有着特殊用途。冷冻蚀刻复型技术是一种冷冻断裂与复型相结合的样品制备技术，该技术在生物学中的广泛应用不仅验证了超薄切片所展示的细胞超微结构，并且还揭示了某些前所未见的新结构，特别是在显示生物膜的结构方面，该技术有着独特作用。5 电镜细胞化学技术电镜细胞化学技术又称超微结构
13、细胞化学技术，它是从光镜组织化学的基础上发展起来的一种超微结构技术，它的任务是研究细胞内各种成分在超微结构水平上的分布情况以及这些成分在细胞活动过程中的动态变化，以阐明细胞的化学和生化功能。其中最重要的是蛋白质（特别是酶的细胞内定位），另一方面是核酸、脂肪、碳水化合物及无机离子的定位。该技术有利的促进了形态学和生物化学的结合，使生命科学的研究进入了新的水平。6 免疫电镜技术免疫电镜技术是通过特殊的标记方法使抗体与电子致密的标记物相结合，然后运用电镜在超微微结构水平上鉴定抗原-抗体的结合反映。在免疫学领域中，这是一种非常有用的实验技术。7 电镜放射自显影技术电镜放射自显影技术是一种运用放射性同位
14、素作为标记物对细胞化学物质进行超显微结构的定位、定性或定量研究的技术。这种技术不仅用于对重要的代谢物质进行定位、定性或定量，并且还用于显示抗原-抗体的结合，激素或药物与受体的结合，显示病毒的感染与复制部位等。因此这是一种非常有用的现代生物学技术。体金标记免疫电镜包埋前胶体金标记免疫电镜胶体金探针（3nm）即使在使用穿透剂的情况下也不易穿透细胞，因此经常用于细胞表面抗原的标记。20世纪90年代，国外成功制备了1nm金标记的探针，这种探针容易穿透组织和细胞，已成功应用于标记细胞内抗原。包埋前免疫标记时，在标本未作固定或轻微固定后进行免疫标记，标记后再用2戊二醛+2多聚甲醛固定以获得较好的超微结构保
15、存。这种方法特别合用于标记对固定剂敏感的抗原。在标记细胞膜表面成分时，应注意免疫标记也许会引起细胞膜成分的重分布，抗体与未固定或轻微固定的细胞膜成分的结合也许会引起这些分子的聚集、成帽或内吞。通常用含低浓度戊二醛的固定液作短暂固定，能有效防止膜分子的重分布。单独用多聚甲醛固定或在4做免疫标记局限性以防止质膜分子向周边扩散。细胞表面抗原标记（间接法）细胞用PBS洗两次，用0.5戊二醛+2多聚甲醛在室温下固定0.5lh。可根据抗原对固定剂的敏感度选择恰当的固定液，对某些抗原可完全不用戊二醛，用4多聚甲醛固定14h。用PBS漂洗35次，每次20 min。 用0.1 mol/L甘氨酸漂洗细胞5min，灭活自由醛基。这一环节对用戊二醛固定的细胞尤为重要，由于戊二醛具有两个醛基，在固定期其中的一个醛基也许与细胞成分结合，而留下一个自由的醛基，若这个自由的醛基不被阻断，则能与阻断液中的蛋白或抗体结合，从而增长非特异性背景染色。 用含1BSA的无钙镁Dulbeccos PBS漂洗细胞15min，以阻断对一抗的非特异性结合。阻断液可以是210BSA
