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1、食品接触材料 高分子材料 食品模拟液中偶氮甲酰的测定 高效液相色谱法编制说明一， 任务来源本标准是由国家认监委下达的2010年出入境检验检疫行业标准制修订计划项目食品接触材料检测方法 高分子材料 偶氮甲酰胺含量和迁移量的测定（立项编号为2010B165），由江苏出入境检验检疫局负责起草。由于偶氮甲酰胺含量和迁移量检测方法差异性较大，为使标准内容清晰，便于使用，体现本标准的主要技术方法，同时为了与现已发布的食品接触材料行业标准一致，将标准题目修改为食品接触材料 高分子材料 食品模拟液中偶氮甲酰胺的测定 高效液相色谱法。二， 立项背景“民以食为天”，食品历来是与人们健康安全密切相关的敏感商品，一直
2、受到国内外消费者的高度重视和关注。世界各国特别是美国、欧盟、日本等发达国家的分析与研究结果表明，与食品接触的器皿、餐厨具和包装容器以及包装材料中有害元素、有害物质已经成为食品污染的重要来源之一。我国出口食品接触材料在国际市场占有率呈逐年上升趋势，同时因安全、卫生不符合美国、欧盟、日本等发达国家的法规标准，而被禁止进境、退货及销毁等情况也不断增多。近年来，以聚氯乙烯（PVC）为主要原料的塑料垫圈被广泛使用在各种金属盖玻璃瓶包装中。为了改善塑料垫圈的密封性，避免微生物污染导致食品变质，常在PVC垫圈的生产原料中加入偶氮甲酰胺（以下简称ADC）作为发泡剂。含有ADC发泡剂的垫圈在密封玻璃瓶以及消毒处
3、理过程中，需要经过高温处理，在加热条件下，垫圈中的ADC会分解生产氨基脲（Semicarbazide,以下简称SEM），进入食品当中，对与其接触的食品造成污染，为此我国GB9685-2008明确规定PE、PC、PVC等塑料包装中偶氮甲酰的最大使用量不得超过2.0%,。橡胶中不得超过5.0%，欧盟2004/1/EU指令规定自2005年8月2日起，停止偶氮甲酰作为发泡剂使用，要求企业开发使用更加环保的替代品。因此，为了降低我国此类产品的出口风险，帮助出口企业应对国外技术壁垒，树立中国制造的国际形象，急需制定食品接触材料中ADC迁移量的检测方法标准，为日常的检验监管工作提供技术支撑。三， 标准主要内
4、容和制定依据1， 主要内容本标准规定了食品模拟物ADC的高效液相色谱测定方法。本标准适用于水、10%乙醇（v/v）、3%乙酸（w/v ）以及橄榄油4种食品模拟液中ADC含量的测定。2， 制定依据本标准依据GB/T 1.1-2009标准化工作导则第一部分：标准的结构和编写规则及GB/T 20001.4-2001标准编写规则 第4部分：化学分析方法规则编写。四， 标准技术内容的论证1， 实验验证部分1.1 仪器与材料高效液相色谱仪：美国Aglient 1200 Series，配有紫外检测器及化学工作站；色谱柱：Agilent HC-CN柱(250 mm4.6 mm （i.d.），5mm)；离心机：
5、上海安亭KA1000；分析天平：德国METTLER TOLEDD AG 285；超纯水器：美国Millipore；津腾微空滤膜过滤器。1.2 高效液相色谱条件流动相：甲醇-水(15：85，v/v）混合溶液；流速 0.8mL/min；进样量：20mL；柱温：25；紫外检测波长：250nm。1.3 试剂和药品甲醇色谱纯（德国GmbH公司）；实验用水为超纯水（美国Millipore公司超纯水器制备）；乙醇（分析纯）；冰醋酸（分析纯）；精制橄榄油；ADC（纯度99，Alfa Aesar公司）。1.4 标准工作溶液的制备1.4.1 水基食品模拟物标准工作溶液1.4.1.1标准储备液：准确称取ADC标准品
6、各0.1g于100 mL容量瓶中，精确至0.1mg，用N,N-二甲基甲酰胺（以下简称DMF）定容至刻度，摇匀配成1000 mgL的标准储备溶液，4避光保存。1.4. 1.2标准工作液：准确移取适量的标准储备液（1.4.1.1）用水逐级稀释成浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg/L的ADC标准工作溶液。采用同样的方式，分别用3%乙酸（w/v）和10%乙醇（v/v）配置同样浓度系列的标准工作溶液，经0.45mm滤膜过滤后供高效液相色谱进样。1.4.2 橄榄油标准工作溶液1.4.2.1标准储备液：准确称取ADC标准品各0.1g于100 mL容量瓶中，精确至0.1mg，然后向容
7、量瓶中加入一定量橄榄油，使容量瓶总质量达100.0g，精确至0.1mg。摇匀后在4避光保存。1.4.2.2标准工作液：准确移取适量的标准储备液（1.4.2.1）用橄榄油逐级稀释成浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg/L的ADC标准工作溶液。分别准确称取2.0g（精确至0.1mg）ADC标准工作溶液于6个10mL的具塞离心管中，向每个离心管中加入2mLDMF，漩涡混合5min后，高速离心（3000r/min）6min，放置2min。分别移取上清液于10mL具塞试管中，经0.45mm滤膜过滤后供高效液相色谱进样。1.5 实际样品的制备1.5.1总则食品模拟物试液按照GB/T
8、 23296.1-2009的要求从迁移试验中获取，在4 冰箱中避光保存。1.5.2水基食品模拟物准确量取迁移实验（1.5.1）中得到的水基食品模拟物约1mL，经0.45mm滤膜过滤后供高效液相色谱进样。1.5.3橄榄油模拟物准确称取迁移实验（1.5.1）中得到的橄榄油模拟物2.0g（精确至0.1mg）于10mL的具塞离心管中，向离心管中加入2mLDMF，漩涡混合5min后，放置2min，高速离心（4000r/min）6min。移取上清液，经0.45mm滤膜过滤后供高效液相色谱进样。2， 结果与讨论2.1紫外检测波长的选择配制10mg/L的ADC水溶液分别进行紫外扫描，如图1所示，ADC的紫外最
9、大吸收分别在250nm，因此为了提高分析方法的灵敏度，本方法选择的紫外检测波长为250nm。图1 10mg/LADC水溶液的紫外光谱图2.2 流动相的选择考察了在不同流动相极性条件下，Agilent HC-CN柱对ADC的色谱分离情况。结果如图2、图3和图4所示，由于ADC都属于弱极性物质，随着流动相极性增大，ADC在CN色谱柱上的保留时间延长，分离度增加。当水和甲醇的体积比为85：15时，两种目标物的分离度适中，分析时间也较短，再增加流动极性ADC 与DMF的分类度并没有改善，因此本方法选择水/甲醇（85：15）为最佳流动相。1ADC；2DMF。图2 10mgL 3%HAC标准溶液的色谱图（
10、水/甲醇=80/20）1ADC；2DMF。图3 10mgL 3%HAC标准溶液的色谱图（水/甲醇=85/15）1ADC；2DMF。图4 10mgL 3%HAC标准溶液的色谱图（水/甲醇=90/10）2.4 橄榄油模拟物前处理方法的选择2.4.1 提取溶剂的选择准确称取2.0g 10mg/kg ADC橄榄油混合标准工作溶液于3个10mL的具塞离心管中（精确至0.1mg），向3个离心管中分别加入2mL乙腈、丙酮和DMF，漩涡混合5 min后，放置2min，高速离心（3000r/min）6min，移取上清液于10mL具塞试管中，经0.45mm滤膜过滤后供高效液相色谱进样。结果如表1所示，3种有机溶剂
11、中，DMF对ADC的提取效率最高。表1 不同溶剂的提取效率溶剂加标量（ug）实际测定值(ug)提取率（）乙腈20.123.0014.91丙酮20.2515.1774.91DMF20.3118.6091.58注：实际测定值以水标准溶液计算2.4.2 提取方式的选择准确称取2.0g 10mg/kgADC橄榄油混合标准工作溶液于2个 10mL的具塞离心管中（精确至0.1mg），向2个离心管中分别加入2mLDMF。一个离心管在室温下超声15min，另外一个离心管在室温下漩涡提取5min，放置2min，高速离心（3000r/min）6min。分别取两个离心管的上层清液过0.45mm滤膜过滤，再进高效液相
12、色谱分析。结果如表2所示，两种提取方式的提取效率比较接近，考虑到超声会导致溶剂挥发，本标准选择漩涡提取的方式。表2 不同提取方式的提取效率提取方式加标量（ug）实际测定值(ug)提取率（）超声21.1118.5087.64漩涡21.2518.7488.18注：实际测定值以水标准溶液计算2.4.3 提取次数的选择准确称取2.0g 0.6mg/kgADC橄榄油混合标准工作溶液于10mL的具塞离心管中（精确至0.1mg），向离心管中加入2mL乙腈，在室温下漩涡提取5min，放置2min后高速离心（3000r/min）6min，静直取上层清液过0.45mm滤膜，进高效液相色谱分析。剩余的下层油层继续乙
13、腈提取4次，每次2mL，收集每次提取后的上层清液过0.45mm滤膜后，进高效液相色谱分析。结果如图4所示，随着乙腈提取次数的增加，上层清液中的ADC含量逐渐减少。在满足国外技术法规限量的同时，为了简化试验步骤，降低多次操作带来的误差，本标准采用2mLDMF提取1次后，取上清液直接进样。图5 DMF连续5次提取效率的柱状图2.5 线性关系和测定低限将水基食品模拟物标准工作溶液（1.4.1.2）和橄榄油标准工作溶液（1.4.2.2）在最佳实验条件下进行分析。以标准工作液的浓度（mg/L或mg/kg）为横坐标，峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线。实验结果表明，3种水性模拟液在0.5mg/L3mg/L范围
14、内线性良好，橄榄油模拟液在0.5mg/kg3mg/kg范围内线性良好。将4种模拟物的标准工作溶液逐级稀释，以3倍信噪比（S/N=3）确定方法的测定低限。4种模拟物的工作曲线，线性方程以及测定低限见表3。表3 ADC4种模拟物标准溶液的线形方程、相关系数及测定低限模拟物线形方程相关系数（r）检测限(mg/L)水y = 24.909x - 0.240.99990.0510%乙醇水溶液y = 23.821x + 0.120.99990.053%乙酸水溶液y = 23.127x + 0.100.99970.05橄榄油y = 22.754x + 0.300.99950.10(mg/kg)1ADC；2DM
15、F。图6 0.5mg/L ADC水标准溶液色谱图1ADC；2DMF。图7 0.5mg/LADC10%乙醇标准溶液色谱图1ADC；2DMF。图8 0.5mg/LADC3%乙酸标准溶液色谱图1ADC；2DMF。图9 0.5mg/LADC橄榄油标准溶液色谱图2.6方法的回收率和精密度采用经测定不含ADC的PVC瓶盖垫片为空白样品，对4种模拟液分别进行添加回收率和精密度实验。样品添加不同浓度的标准溶液，在本标准的条件下进行高效液相色谱测定，结果见表5。1ADC；2DMF。图10 水模拟物中0.05mg/L添加水平色谱图1ADC；2DMF。图11 10%乙醇模拟物中0.05mg/L添加水平色谱图1ADC；2DMF。图12 3%乙酸模拟物中0.05mg/L添加水平色谱图1ADC；2DMF。图13 3橄榄油中0.05mg/L添加水平色谱图表4 方法的回收率及精密度试验（n=6）模拟物添加水平实测值1实测值2实测值3
