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1、四种青藏高原当地药用作物果实多糖的抗疲劳活性摘要： 医学相关性：沙棘果、枸杞、黑枸杞和柴达木唐古特白刺的果实是西藏地区的传统药用食品， 在减轻由缺氧引起的疲劳等方面的应用已经有千年的历史。本研究目标在于探索这四种来自 青藏高原的标志性浆果中植物多糖的抗疲劳活性。原料和方法：沙棘果、枸杞、黑枸杞和柴达木唐古特白刺的果实收集于中国青海海西蒙古族 藏族自治州（N 36.321, E98. Ill；海拔高度：3100米），其多糖成分（HRWP, LBWP, LRWP, NTWP）通过热水进行分离提取，通过DEAE纤维素离子交换层析法进行提纯。分光光度法获 得碳水化合物、糖醛酸、蛋白质和淀粉多糖骨架。凝
2、胶过滤层析测定多糖的分子质量。通过 吡唑啉酮（PMP）柱前衍生高效液相色谱分析其单糖组分。每日给小鼠口服摄入HRWP、LBWP、 LRWP和NTWP （剂量分别为50, 100 and 200 mg/kg）。采用负重游泳试验（FST）、自动分析 仪和市售试剂盒测定血清生化指标,称量身体和器官重量,评估抗疲劳作用。结果：LBWP,LRWP和NTWP由葡聚糖和RG-I果胶组成，HRWP由HG型果胶和葡聚糖组成。这 四种多糖都可延长负重游泳实验中小鼠的竭力游泳时间，HRWP和LRWP比LBWP和NTWP的效 果更明显。对照组和实验组的小鼠的肝脏和心脏指标无明显区别，但是在LBWP和NTWP （200
3、mg/kg）处理的小组中，小鼠的脾脏指标出现上升。此外，负重游泳实验促使还原糖（Glc）、 超氧化物歧化酶（SOD。及谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）水平降低，肌酸激酶（CK）、乳酸脱 氢酶（LDH）、血尿素氮（BUN）、甘油三酯（TG）及丙二醛（MDA）的水平升高。HRWP、LBWP、 LRWP 和 NTWP 在一定程度可抑制全部疲劳指标，同等剂量下， LBWP 和 NTWP 的效果比 HRWP 和 LRWP 好。结论：四种青藏高原浆果植物中存在的水溶性多糖HRWP，LBWP，LRWP和NTWP可显著增强抗 疲劳活性。通过改变几种酶活性，预防脂质氧化，保护红细胞膜，影响运动过程中的甘油三 酯（T
4、G）（或脂肪）动员活动。研究表明，LBWP和NTWP比HRWP和LRWP更有效，适用于抗 疲劳和抗氧化功能的功能性食品。1.引言疲劳最好的定义为发起或维持的自愿活动的困难，并可以分为精神疲劳和身体疲劳 （Tanakaetal. , 2008） 。疲劳是影响物理性能的重要因素，常发生在衰老、癌症、抑郁症、 艾滋病病毒感染、多发性硬化症和帕金森氏病等多个因素中 （Belluardo et al., 2001; Tharakan et al., 2006; Huang et al.2011。） 迄今为止，有效治疗疲劳的药物或疗法仍不 能满足人们的需要。因此，人们更注重寻求天然的抗疲劳化合物，而无副作
5、用，提高运动能 力，延缓疲劳（Kimet al., 2002; Uthayathas et al., 2007）近年来，药用植物多糖被认 为是一种新型的天然抗疲劳物质 （Wang et al. , 2010; Chen and Zhang, 2011 ;Sheng et al. , 2011; Hu et al., 2012; Tan et al., 2012）。青藏高原，由于其高海拔和长日照，被称为地球的第三极。在高原缺氧环境下，人很 容易疲惫。所以，在藏药体系中，很多原生植物和水果都用来减轻缺氧引起的疲劳 （Ma et al.,2011）。记录在经典的藏药理书“水晶珍珠纲目”汉语拼音是：j
6、ingzhubencao; Dierma, 2012）的沙棘果，枸杞，黑枸杞和柴达木唐古特白刺都是几千年来民间土生土长的抗疲劳药 物，是藏族传统的药用食物。最近的研究表明，沙棘果含有大量生物活性物质如维生素、类胡萝卜素、植物甾醇、 有机酸，多不饱和脂肪酸和一些必需氨基酸（Kanayama et al., 2012）。枸杞果实和其多糖 拥有一系列的生物活性，包括抗老化、神经保护、增加代谢、控制糖尿病患者血糖、缓解青 光眼、抗氧化、免疫调节、抗肿瘤和细胞保护作用 （AmagaseandFarnsworth,2011;Jinet al., 2013）。黑枸杞果实中含有丰富的花青素和高度支化的聚糖蛋白
7、（Zheng et al., 2011; Peng et al., 2012）。柴达木唐古特白刺果实含有几种生物碱和黄酮类物质包括尿囊素、MTCA 和槲皮素（Wang et al., 2007; Suo and Wang,2010）。然而，以往的研究主要集中在白刺、 沙棘以及枸杞的小分子化合物的结构特征和药理活性评价。即使多糖的研究热点之一枸杞多 糖，也缺乏对其抗疲劳活性分析。据我们所知，到目前为止，没有关于四个青藏高原当地浆 果植物的果实多糖抗疲劳活性的研究报告。在文中，将沙棘，枸杞、黑枸杞和白刺的水溶性多糖进行分离、纯化并进行成分分析， 测定抗疲劳和抗氧化活性，使用青藏高原特色浆果探索具有
8、显著抗疲劳作用的天然多糖。2.材料和方法2.1植物原料和化学试剂沙棘、枸杞、黑枸杞和白刺是从中国青海海西蒙古族藏族自治州都兰各地收集（N 36.321, E98. 111;海拔高度：3100米）。材料是由中国西宁中国科学院西北高原生物研究所薛峰璐教 授鉴定。标本馆标本编号为HR20110805的沙棘、LB20110802的枸杞，LR20110719的黑枸杞 和NT20110802的白刺，存放在青海省藏医学药理学与安全性评价重点实验室。DEAE-纤维素柱及Sepharose CL-6B凝胶均购自Pharmacia公司。标准葡聚糖和单糖（半 乳糖，阿拉伯糖，D-岩藻糖、鼠李糖，D-甘露糖、木糖、葡
9、萄糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸） 购自从西格玛公司（美国州的圣路易斯）。所有其他试剂均为分析纯，中国制造。2.2 实验动物雄性 BALB/c 雄性小鼠（8 周龄），采购自吉林大学药理学实验中心（长春，中国）。在 实验过程中，小鼠在室温下处于一个12 / 12 h光暗周期并可以自由获取符合啮齿动物食用 标准的食物和水。动物处理程序符合美国国立卫生研究院动物护理和使用指南。机构动物伦 理委员会在实验之前审查了整个动物协议。2.3 多糖制备首先风干植物材料，然后在95%乙醇回流的下提取12 h,完全去除疏水性化合物。这 一步重复三次。过滤后通过一个纱布（100 目），将残留物在室温下干燥，然后用热水提
10、取（90C, 1:20 w / v）三次（每次6小时）。获得的水溶液混合、浓缩，随后将95%乙醇添 加到用离心法分离收集的含量高达80%的多糖滤液，进行真空干燥。沉淀物溶解在水中（5% W/V）,通过离心除去不溶性物质。上清液装入DEAE-纤维素柱，然后用0.5 M NaCl洗脱。 收集洗脱液，浓缩至最小体积，透析，最后冻干得多糖。从青藏高原四个特色浆果中获得水溶性多糖，分别从沙棘中提取HRWP,柴达木枸杞中 提取LBWP，黑枸杞中提取LRWP和从白刺中提取NTWP。在每个多糖溶液中的内毒素水平小于 0.5 欧盟（内毒素单位） /毫升。2.4 分析方法以葡萄糖为标准，用硫酸苯酚法测定总糖含量（
11、Dubois et al., 1956）。以半乳糖醛酸 为标准，通过羟基联苯比色法测定糖醛酸含量（Blumenkran tz and Asboe Hansen， 1973）。 以托马斯亮蓝试剂与牛血清白蛋白作为标准，由Sedmak and Grossberg （1977）法测定蛋白 质含量。以可溶性淀粉为标准，根据Gur et al. （1969）的方法测定淀粉含量。由琼脂糖分 子量分布凝胶CL-6B （85 cm1.5 i.d.）过滤层析。根据制造商的说明使用E-T0XATE检测试 剂盒（Sigma，圣路易斯，美国）分析污染物的内毒素鲎（LAL）。Honda et al （1989）所描述的
12、进行的单糖分析。简单地说，将120C样品（2mg）用2 M CF3C00H （1.0ml）水解。水解产物（单糖）衍生的0.5M 1-phenyl-3-methyl5吡唑啉酮（PMP） 和 0.3 M NaOH 在中和 0.3 M HCl，PMP 衍生物在 Agilent 1100分析配备 Agilent Eclipse XDB-C18柱高效液相色谱系统（250毫米4.6毫米，5“m）与一个保护柱通过在245纳米的 紫外吸收。2.5 抗疲劳实验设计小鼠分为以下实验组（6只小鼠/组）：完整组用生理盐水处理，不进行游泳实验 （Mizoguchi et al., 2011）；另一组用生理盐水处理，并进
13、行游泳实验。实验组给予不同 剂量的多糖（HRWP、LBWP、LRWP和NTWP） （50, 100和200 mg/kg），并进行游泳实验。 小鼠口服多糖15天（上午7:00），最后一天复合给药后1 h进行负重游泳实验。用乙醚麻醉小鼠，收集每个治疗组的血液样本。血清样品3000g，离心10 min，4C） 存放在80C条件下进行下一步的分析。称量脾脏、心脏和肝脏重量，计算最终的体重（器 官）指标。2.6 负重游泳实验FST （负重游泳试验，简称FST）和Porsolt et al. （1978）所描述的一样。简而言之， ICR小鼠单独放置在玻璃瓶（高：25cm，直径：10cm）,含有10cm水，
14、在23 - 25C下，6分 钟一组。在实验结束时，将小鼠从水里取出，用纸巾擦干，放在的笼子里。每组实验后容器 中的水都有改变。力竭时间是由一个受过训练的实验人员手动记录，未知的实验条件下，在 最后4分钟的测试期间，力竭的定义是当老鼠不再挣扎，在水里漂浮不动，只做那些保持他 们的头在水上的动作。2.7 血清检验在小鼠腹腔注射氯胺酮麻醉（80 mg/kg）和甲苯噻嗪（4毫克/公斤）。麻醉后，血液从 负重游泳小鼠的心脏注入。然后，血清通过3000转速在4C10分钟离心分离法制备。内容 物由葡萄糖（Glc）、血清乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶（CK）、甘油三酯（TG）的自动分析 仪测定（日立7060、
15、日立、日本）。血中尿素氮（BUN）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、 谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）通过从建成生物工程研究所的市售试剂盒测定（南京，中国）。2.8统计分析统计分析显著性由单因素方差分析和Dunnetts事后比较确定。所有的值表示为P 0.05，被认为是显著的。3.结果与分析3.1药用浆果多糖分析通过热水提取和 80%乙醇溶液沉淀，从沙棘、枸杞、黑枸杞和白刺果实中分离出四种多 糖组分，分别被命名为 HRWP， LBWP， LRWP 和 NTWP。 HRWP 是黄褐色粉末，占沙棘果干重的 5.5%； LBWP是浅棕色粉末，占枸杞果实干重的4%； LRWP是深褐色的粉末，占
16、黑枸杞干重的 10.3%； NTWP是浅棕色粉末，占白刺果实干重的4.8%。四种多糖组分的碳水化合物含量通过苯酚-硫酸法确定95%以上。由于采用DEAE-纤维素 离子交换层析法去除蛋白多糖组分，蛋白质含量低于1.2%。其紫外光谱没有在260纳米处 的峰，这表明，不含核酸。Limulus amebocyte lysate （LAL）检测显示小于0.05欧盟/毫 克，这表明结果为负。总糖、糖醛酸、蛋白质、淀粉含量和各多糖产量列于表1，其单糖组 成和分子量分布在图 1 和表 2。结果表明LBWP，LRWP和NTWP分子主要由葡聚糖组成，在缺失淀粉的情况下，葡聚糖不 是a -(1,4)或a -(1,6)糖苷键连接，还包括一些鼠李糖和半乳糖醛酸。为确定LBWP的RHA /半乳糖醛酸的比率，LRWP和NTWP分别为0.33，0.21和0.38，其中，在鼠李半乳糖醛酸I (RG-I )的范围从0.05到ISchols and Voragen (19
