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1、人体X染色质观察 生76 刘森 2007030073 同组人：李逸群 周斐 廖若西 袁堂谧 蒋超 刘铁军一、 实验目的1通过实验掌握鉴定人类X染色质的方法，在显微镜下正确识别Barr小体的特征及其所在位置。了解X染色体失活的有关理论假说以及失活染色体尚的基因所控制的遗传形状的特点。二、 实验原理雌性个体细胞的2条X染色体中，有一条在间期是处在不活动的异固缩状态，从而形成了X染色质又称Barr小体。后来人们知道这和情况在哺乳类动物的雌性个体都存在，即雌性哺乳类动物细胞内的X染色体在间期内仅有一条呈松散状态，参加细胞生理活动，另一条则保持固缩状态。Barr小体出现在哺乳动物雌性个体细胞的细胞核边缘
2、，这主要是因为这条染色体处在失活状态，在DNA复制时总是落后于其他染色质所致。剂量补偿效应是指XY型性别决定的生物，由X性染色体上的基因决定的性状在两性的表现几乎相同。也就是说X染色体上的基因的表达产物在雌雄动物的细胞中是等量的。这种剂量补偿效应可以通过两种途径实现：一是X染色体的转录速率的差异，即雌性动物细胞中的两条X染色体的转录速率低于雄性细胞中单条X染色体的转录速率，因而造成雌性和雄性细胞的总体表达水平接近；二是雌性细胞中有一条X染色体在功能上是失活的。1966年，M.F.Lyon根据许多研究结果提出了X染色体失活的假说，主要内容为：在正常的雌性哺乳动物的体细胞中，一条X 染色体在遗传上
3、有活性，而另一条处于失活状态。这种失活发生在胚胎发育的早期，失活是随机的。但是一旦发生了失活，这个细胞的后代将处于失活状态。X 染色体上的杂合基因将出现嵌合现象。Lyon 假说虽然可以解释一些问题但不是全部，三、 实验器材 光学显微镜，载玻片，盖玻片，牙签，吸水纸，离心机，吸管，固定液，2.0g/L甲苯铵蓝染色液，生理盐水。四、 实验步骤1取材：先漱口三次，将口腔内杂物漱出。然后用牙签的钝面刮取口腔颊部粘膜细胞，将其放人盛有3ml生理盐水的离心管中，轻轻摇动使细胞分散于生理盐水中。2离心收集细胞：以1600 r/min离心1Omin。3固定：离心结束后，轻轻将上清液除去。留下的沉淀物用固定液固
4、定10min。4离心：1200 r/min离心1Omin。5制备细胞悬液：去掉上清液，根据细胞沉淀量加入1ml新配制的固定液，用吸管吹打成细胞悬液。6滴片：用吸管将细胞悬液滴在载玻片上，在空气中干燥。7酸解：当载玻片上的固定液全部挥发后，在载玻片上滴加5M HCl，处理10min，然后用清水漂洗几遍。8染色：在2.0g/L甲苯胺蓝染色液中染色30min。染色结束后，用清水漂洗以去掉浮色，在空气中自然干燥。9镜检：在油镜下依次观察细胞核着色均匀、核膜完整的细胞若干。10辨认Barr小体，区分样品来源：在油镜下观察Barr小体，通过统计50个细胞中Barr小体的数量来判断此样品来自男性还是女性。全
5、组辨别完后，在助教处核对答案。五、 实验结果1 样品来源辨别我们组原有7管样品，3男4女。离心前有同学误以为已离心，将87倒掉。因为87中唾液含量较多，泡沫明显，可以判断来源，故让该同学重新取样。第一次离心时，83、84两管由于转速偏高，碎在了离心机里，因来源不明，征求老师意见后重取1男1女2份样品，标为88，89。故我组7份样品为81、82、85、86、87、88、89。 男性样品特征：染色均匀，比较干净，核膜明显，没有Barr小体似的膜内缘 深染物质。 女性样品特征：染色均匀且较深，能比较明显地看到部分细胞核膜内缘有深染的物 质，呈卵形、短棒形。最后小组判断结果是85、86、89为男性样品
6、，与老师开始时编号一致。2 Barr小体数量统计我一开始镜检的是份男性样品，后借来组内一份女性样品观察，共观察58个核着色均匀、核膜完整的细胞，其中阳性22个，阴性36个，阳性率为37.9。六、 讨论1 Marker笔的油性 助教收回每组的所有样品后，会打乱重新编号，重新发给同学。这时注意不要用手涂marker的位置，以防marker笔油性不好，编号被抹掉，无法核对答案。我们组有2个管的标记被擦掉，所幸还有微弱痕迹，可以用来识别。2 离心机转速选择 书上说1000rpm，老师课上讲需要更高的转速，大约1200rpm1500rpm。我们组在离心时使用了1600rpm，结果非常悲惨，有2个玻璃离心
7、管禁不住强大的离心力，碎在了离心机内。导致我们重新制了2管样品，全组受此影响5点多才结束。3 盲实验这次我们采取了盲实验的模式，即男女生混合编组，取样后交给助教，助教登记男女后打乱顺序、改变标记，重新进行编号再发还组员。全体组员经过鉴定得出结果后再找助教核对，如一致则继续进行数量统计，不一致的话需要继续鉴定。这种实验模式给原本枯燥的鉴定实验带来了很多乐趣，通过鉴定未知样品，避免了同学知道样品来源后先入为主的判断。而且这样一来一组同学要紧密合作，同时可以互相指导，增加了教学实验的收获。4 细菌污染我借来的那份女性样品中，在油镜下可以清楚地看到一些微生物，比如弧菌、杆菌、球菌，个体较口腔上皮细胞小
8、许多。而我看的那份男性样品视野比较干净，没有细菌的污染。口腔中生活的微生物确实比较多，建议以后实验前的午饭后可以刷牙，取样前再用清水漱口3次，第一根牙签刮取的样品舍弃，从第二根开始收集。这样可以有效的避免细菌污染。即使污染了也没太大关系，只要能看到足够数量可以用于统计的细胞就行。另外，也熟悉了一下微生物观察的基本知识，还告诉我们人体中是存在大量细菌的，不要忽视他们的存在，否则会得病的。5 女性样品的阳性率 我的实验结果是37.9，从网上查的资料显示各试验室观察的阳性率从3050不等，都远低于100。首先不是每个经过处理的细胞都能将Barr小体成功深染；其次不同人的判断标准不一样，对“深染”的掌
9、握尺度不同。因此造成阳性率较低。七、 思考题 1什么是剂量补偿效应？ 剂量补偿效应是指XY型性别决定的生物，由X性染色体上的基因决定的性状在两性的表现几乎相同。也就是说X染色体上的基因的表达产物在雌雄动物的细胞中是等量的。这种剂量补偿效应可以通过两种途径实现：一是X染色体的转录速率的差异，即雌性动物细胞中的两条X染色体的转录速率低于雄性细胞中单条X染色体的转录速率，因而造成雌性和雄性细胞的总体表达水平接近；二是雌性细胞中有一条X染色体在功能上是失活的。 2Barr 小体分析技术在人类遗传学工作中有什么用途？ Barr小体的临床意义在于鉴别性别。例如运动员参加女子项目，可通过检查其白细胞中有无巴氏小体而确定其性别。现在已不用此技术为判别标准。 3制片过程中使用HCl酸解的目的是什么？ 主要是为了使口腔上皮细胞分散，利于下面的染色和观察。 4描绘所观察到的Barr 小体的形态特征和在细胞中的分布状况。 呈卵形、短棒形，染色较细胞核略深，呈紫色。主要分布在细胞核核膜的内缘，紧 靠膜。少数分布在细胞质中。 5为什么Barr 小体一般出现在核膜边缘？ 主要是因为这条染色体处在失活状态，在DNA复制时总是落后于其他染色质所致。八、 参考文献 1张贵友等，普通遗传学实验指导，清华大学出版社，2003。
