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1、第三十六章 RNA 的生物合成及调控第一节 DNA 指导下RNA 的合成一、DNA 指导的RNA 聚合酶原核生物的RNA聚合酶由2构成核心酶，为起始因子，因子引导RNA聚合酶稳定地结合到DNA的启动子上，不同的菌种因子的大小差别很大,不同的因子可以识别不同的启动子，亚基借助疏水作用与DNA结合,亚基是碱性蛋白，借助静电作用与DNA结合，构成RNA聚合酶的催化中心，亚基与启动子上游元件和活化因子结合，促进酶的装配，因子参与某些基因转录的终止。真核生物的RNA聚合酶对-鹅膏蕈碱不敏感，转录45S rRNA前体，经加工产生5.8S rRNA，18S rRNA 和28S rRNA； RNA聚合酶对-鹅
2、膏蕈碱敏感，转录编码蛋白质的基因和大多数snRNA；RNA聚合酶 对-鹅膏蕈碱中等敏感，转录小RNA，包括tRNA，5S rRNA， snRNA和scRNA 。转录的步骤研究转录起点的方法：足迹法二、启动子和转录因子原核生物的启动真核生物RNA聚合酶启动子的共有序列RNA聚合酶基本启动子的共有序列TATA位于-25至 -30，转录起始部位有一保守序列PyPyA*NT（A）PyPy, 其中的Py表示嘧啶，*表示+1位点。上游调控元件包括CAAT框，GC框和八聚体框等，位置不很确定，不同的细胞可以有不同的上游调控元件，不同的上游调控元件与不同的转录因子相互作用（表36-4）。真核生物RNA聚合酶启
3、动子与转录因子的相互作用TFD是包含TATA结合蛋白（TATA-binding protein,TBP）和多种TBP联结因子（TBP-associated factor,TAF）的寡聚蛋白，可以与RNA聚合酶的C端相互作用。TFB有两个结构域，一个结合TBP。另一个可以引进TFF/pol复合物。TFF有ATP酶，解螺旋酶，激酶等多种活性，可以使RNA聚合酶大亚基的C端磷酸化，引起构像变化，促进转录。还可以参与DNA损伤的修复。黄色为TATA box的糖磷酸骨架，碱基对为红色，相邻的DNA片段为蓝色，马鞍形的TBP（绿色）结合在DNA的小沟，使小沟扩大，并使DNA轴弯曲约100o，使TATA序列
4、解旋。TFD杂聚体的其它组分位于TBP上方，像骑在马鞍上的牛仔。所有真核生物的基因均依赖于TBP。E和H促进除F以外的其他转录因子脱落，使转录由起始阶段进入延伸阶段。前起始复合物的结构。显示pol，TATA box，TBP，TFB（B），TFE（E）的相对位置。转录起始于pol和TFE环绕的区域。电脑构建的TFA-TBP-TFB复合物的结构。注意蛋白质引起的DNA上游和下游的错位。RNA聚合酶的核心启动子位于-45至+20，上游控制元件位于-180至-107，两部分均有富含GC的区域。转录因子UBF1可结合于两部分富含GC的区域，随后结合SL1四聚体蛋白（作用类似与原核生物的因子）。RNA聚合
5、酶的启动子有3种类型，基因内启动子有两种，一种由boxA-中间元件-boxC组成，转录起始时，TFA（一种锌指蛋白）结合到boxA上，然后 TFC（至少5个亚基组成的复合物）结合，后者促进TFB（含有TBP和另外两种蛋白质，能使RNA聚合酶正确定位）结合，并引导RNA聚合酶结合到起始位点上。 另一种由boxA-间隔区-boxB组成，转录起始时， TFC识别boxB，其结合区包括boxA 和boxB，然后依次引导 TFB和RNA聚合酶的结合。第3类启动子位于转录起点的上游， RNA聚合酶可以结合到其中的TATAbox并起始转录，但其上游的邻近序列元件（proximal sequence elem
6、ent, PSE）和八聚体基序（octamer motif, OCT）会增加转录的效率。转录的解螺旋方式如果RNA缠绕在DNA双螺旋上，不会产生超螺旋，但通过这种模式解开双螺旋进行转录是不可能的。拓扑异构酶可以解除超螺旋，使转录泡移动。三、终止子和终止因子大肠杆菌有两类终止子，不依赖于因子的为简单终止子，能形成发夹区，其中常有一段富含G-C区，终点前有一段寡聚U，可能提供RNA聚合酶脱离模板的信号，同时，寡聚U容易从模板脱落。依赖于因子的终止子发夹区不含富G-C区，其后也无寡聚U，在细菌中少见，但在噬菌体中广泛存在。因子为六聚体蛋白质，可结合在新合成的RNA链上，借助水解NTP的能量移动，RN
7、A聚合酶遇到终止子时停止移动，因子追上来与其结合，促进RNA聚合酶脱落，并使RNA从模板脱离。抗终止子可使终止子通读，促进其后的基因转录，噬菌体的前早期基因的产物N蛋白是一种抗终止子，可以使终止子通读，使晚早期基因表达，晚早期基因的产物Q蛋白也是一种抗终止子，能使晚期基因得以表达。真核生物转录的终止了解不多。识别终止子还需要NusA，NusB，NusE，NusG等因子参与，有关问题有待深入研究。第二节 转录的调节控制一、原核生物转录的调节控制1操纵子的结构和调控原核生物的不少基因在加入诱导物后mRNA迅速合成，随之酶滞后合成。当去除诱导物时mRNA的合成很快停止，但酶的合成延迟停止。构建部分二
8、倍体（lacI-/FlacI+）。lacs为阻遏蛋白不可诱导性突变，其阻遏蛋白失去诱导物结合位点；lacI-突变的阻遏蛋白不能形成寡聚物；lacI-d突变的阻遏蛋白不能和DNA结合，且呈负互补（反式显性）；Oc操纵基因的突变使结构基因组成型表达。由此提出操纵子学说。（1）大肠杆菌乳糖操纵子的结构大肠杆菌乳糖操纵子的作用方式乳糖操纵子的降解物阻遏和降解物基因活化蛋白（CAP）的作用。CAP二聚体与DNA的相互作用引起DNA的弯曲。红色为与CAP相互作用的磷原子， cAMP为红色。乳糖操纵子包括三个结构基因（Z、Y、A），三个调控基因（启动基因、操纵基因和CAP蛋白结合位点），以及一个调节基因。调
9、节基因编码阻遏蛋白，阻遏蛋白与操纵基因结合可阻止RNA聚合酶对结构基因的转录。当乳糖存在时，由乳糖转化而成的别乳糖与阻遏蛋白结合，导致阻遏蛋白与操纵基因解离，诱导基因的转录。但是阻遏蛋白脱离操纵基因而解除封闭后，如果没有CAP的作用也不能启动转录。细胞内葡萄糖缺乏、cAMP水平升高时，cAMP与CAP结合形成复合物，并与CAP结合位点结合，可促进RNA聚合酶与启动基因结合并启动转录。所以，乳糖操纵子的诱导作用既需要乳糖的存在又需要葡萄糖的缺乏。当操纵基因突变后，阻遏蛋白即不能与操纵基因结合，结构基因会组成性表达。（2）基因表达的调控方式（3）araBAD操纵子的正调控和负调控araBAD操纵子
10、的作用机制（4）大肠杆菌的色氨酸操纵子特点:（1） trpR（89）和trpABCDE（25）不连锁；（2） 操纵基因在启动子内；（3） 有衰减子（attenuator）；（4） 启动子和结构基因不直接相连，二者被前导顺序（Leader）所隔开。调节：（1） Trp为辅阻遏物（corepressor）；（2）阻遏物和RNA pol 在P,O重叠区产生竞争性抑制；（3）阻遏物的阻遏能力低，是LacR的1/1000；（4）trpO调节合成代谢，存在衰减作用。色氨酸操纵子的阻遏物辨认三种操纵基因。色氨酸操纵子转录本前导区二级结构的变换缺乏多种氨基酸则前导肽不能合成，转录被终止。色氨酸含量很低，但不缺
11、乏其他氨基酸时，前导肽的合成在色氨酸密码子处停顿，不形成终止子，转录可以完成。有高浓度色氨酸存在时，前导肽顺利合成，核糖体占据1和2，使3和4形成发夹结构，转录被终止。色氨酸操纵子衰减作用的机制几种氨基酸合成操纵子的衰减作用前导肽的氨基酸序列2生长速度的调控营养丰富，温度适宜时，细菌的生长速度可以很快，在两个细胞尚未分裂的情况下，新一代的DNA已开始合成，大肠杆菌的倍增时间为25分钟时，平均每个细胞的DNA分子为4.5个，核糖体的数目也很多。当营养严重缺乏时，细菌进入严紧控制状态，氨基酸的缺乏使细菌合成ppGpp或pppGpp，这一信号使细菌的大部分蛋白质合成停止，只合成对生存必不可少的少量蛋
12、白质。3基因表达的时序调控噬菌体基因表达的时序调控研究较深入，其50个基因组成4个操纵子，即阻遏蛋白操纵子，左右两个早期操纵子和晚期操纵子，左向转录的为L链，右向转录的为R链，当噬菌体侵入宿主细胞后，前早期和后早期的基因首先表达，随后，若晚期基因表达，噬菌体进入裂解循环，若合成阻遏蛋白，则进入溶原状态。右早期操纵子的调节基因cro可抑制溶原型阻遏蛋白cI的合成，使噬菌体进入裂解循环，左早期操纵子的调节基因N的表达产物为抗终止子，使前早期基因的转录越过终止信号进入后早期基因，后早期基因包括左右早期操纵子的3个调节基因，c/c与建立溶原状态的阻遏蛋白的合成有关，Q调节基因的产物亦为抗终止子，使晚期
13、基因表达，噬菌体进入裂解循环。基因表达的时序调控是发育生物学的基础。第三节 真核生物转录的调节控制1顺式作用元件：指可影响自身基因表达活性的DNA序列，包括：核心启动子，如 TATA 框；上游启动子，如 CAAT框,GC框；远上游顺序，如增强子，衰减子、 静息子，酵母的UAS（upstream activator sequences）等；特殊细胞中的启动子成分，如淋巴细胞中的Oct（octamer）和B。2反式作用因子：转录调节因子由某一基因表达后，通过与特异的顺式作用元件相互作用（DNA-蛋白质相互作用），或通过与其它调节因子的相互作用（蛋白质-蛋白质相互作用），反式激活另一基因的转录，可以
14、分为3类；通用反式作用因子，主要识别启动子的核心启动成分，如TBP；特殊细胞的反式作用因子，如淋巴细胞中的Oct-2；同反应性元件（response elenents）结合的反式作用因子，如HSE（热休克反应元件，heat shock response element），GRE（糖皮质激素反应元件glucocorticoid response element）；MRE（金属反应元件，metal response element）；TRE（肿瘤诱导剂反应元件，tumorgenic agent response element）相应的反式作用因子。3几种真核生物promoter的结构真核生物的pr
15、omoter 与增强子的距离和方向差别很大，转录因子与增强子结合促进其与promoter 靠近，并促进基因的表达。金属硫蛋白的promoter 由多个元件构成，特异应答元件如MREs（金属应答元件）和GRE（糖皮质激素应答元件）。BLEs 元件（基础水平元件）与基础表达（组成性表达）有关，TRE 是一个肿瘤应答元件，可以被促肿瘤佛波脂如TPA（tetradecanoyl phorbol acetate,四癸基佛波乙酸脂）活化。AP 为反式作用因子。增强子通过蛋白质介导与promoter 相互作用，形成的DNA 环使增强子结合的特异转录因子与同promoter 结合的转录因子及RNA 聚合酶相互作用。转录因子与RNA 聚合酶的蛋白质：蛋白质相互作用活化基因的转录。4DNA结合蛋白基序的结构（1）螺旋-转角-螺旋基序二聚体与DNA的二重对称位点结合，辨认螺旋（红色）与DNA的大沟结合，另一个螺旋（紫色）帮助辨认螺旋锁定在特定的位置。几种蛋白质中的螺旋-转角-螺旋基序蛋白质与DNA的双位点相互作用（2）Zn-指C2H2基序与DNA的相互作用。3个
