《UVB 诱导人皮肤成纤维细胞凋亡与胱天蛋》由会员分享，可在线阅读，更多相关《UVB 诱导人皮肤成纤维细胞凋亡与胱天蛋（9页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、精品论文UVB 诱导人皮肤成纤维细胞凋亡与胱天蛋白酶-8 关系的研究徐浩翔1，闫言2，李莉3，王宝玺15（1. 中国医学科学院 皮肤病研究所皮研室，南京，210042；2. 中国医学科学院北京协和医院皮肤科；3. 北京朝阳医院皮肤科；)10摘要：目的: 在 UVB 诱导皮肤成纤维细胞急性损伤过程中，探讨细胞凋亡及其与胱天蛋白 酶-8（caspase-8）的关系。方法：人皮肤成纤维细胞经 100、200、300 和 400mJ/cm2 UVB 照射后 48 小时，用 MTT 法检测细胞活性变化，用 Hoechst 33258 染色法检测细胞凋亡，并 用抑制剂 Z-IETD-FMK 抑制 casp
2、ase-8 活性后，检测凋亡细胞数量。结果：（1）100、200、300 和 400mJ/cm2 UVB 能够明显抑制成纤维细胞活性，引起细胞凋亡，随着照射 UVB 剂量15的增加，凋亡细胞逐渐增多；（2）抑制剂 Z- IETD -FMK 能够抑制 UVB 照射引起的细胞凋 亡。结论：UVB 照射能够诱导皮肤成纤维细胞出现凋亡，在这一过程中 caspase-8 发挥着重要作用。关键词：紫外线 B；人皮肤成纤维细胞；凋亡；胱天蛋白酶-820Study of the relationship between cell apoptosis and caspase-8 in ultraviolet B
3、-damaged human dermal fibroblastsXu Haoxiang1, Yan Yan2, Li Li3, Wang Baoxi125(1. Department of dermatology, Institute of Dermatology, Chinese Academy of MedicalSciences,Nanjing 210042;2. Department of dermatology, Peking Union Mediacl Hospital, Chinese Academy of MedicalSciences;3. Department of de
4、rmatology,Peking Chaoyang Hospital)30Abstract: Objective: To explore whether cell apoptosis appeared and the relationship between cell apoptosis and caspase-8 in UVB-induced damage of human skin fibroblasts. Methods: Primary human skin fibroblasts were cultured in vitro and subcultured, 3 to 6 passa
5、ges of cells were used in experiments. Cell viability affected by 100, 200, 300 and 400mJ/cm2 UVB was measured by the 3-(4,5)- dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-diphenytetrazoliumromide (MTT) assay at 48 hours after35irradiation. Through Hoechst staining, the morphological changes of nuclear in cells tre
6、ated by UVB without/with caspase-8 inhibitor (Z-IETD-FMK) were observed and the numbers of apoptotic cells were counted. Results: When cells were treated with 100, 200, 300 and 400mJ/cm2UVB, cell viability decreased with the increasing of UVB dose. UVB could induce cell apoptosis, and when the activ
7、ity of caspase-8 was inhibited by Z-IETD-FMK, UVB-related apoptotic cell40numbers decreased. Conclusion: In the process of acute photo-damage, UVB could trigger apoptosis of human dermal fibroblasts, and the role of caspase-8 was important.)Key words: ultraviolet B; human skin fibroblasts; apoptosis
8、; caspase-3基金项目：教育部高校博士点基金（编号：20111106120052）作者简介：徐浩翔（1981-），男，主治医生，主要研究方向炎症性皮肤病和美容相关性皮肤病通信联系人：王宝玺（1962-），男，主任医生，主要研究方向美容性皮肤病和炎症性皮肤病. E-mail:- 1 -0引言45到达地面的紫外线中含有长波紫外线（ultraviolet A，UVA）和中波紫外线（ultraviolet B，UVB），其中 UVA 约占 95%，UVB 约占 5%，与 UVA 相比， UVB 的光子能量是 UVA 的 1000 倍左右，所以，UVB 对皮肤细胞的影响不容忽 视。目前，有关 U
9、VB 影响人皮肤成纤维细胞凋亡的研究报道较少，而在凋亡过 程中胱天蛋白酶-8（caspase-8）作用重要，故本文探讨了在急性光损伤过程中，50UVB 诱导的人皮肤成纤维细胞凋亡和 caspase-8 的关系。1材料与方法1.1 材料健康青少年男子环切术切除的包皮，加入 0.25% Trypsin 消化。取出 消化后的包皮组织将表皮剥离，加入 PBS，将组织剪碎、吹打，离心含细胞的 PBS 悬液，弃上清，加入 DMEM 培养基（含 10% FBS），接种于培养皿内，置55于 37 5%CO2 孵箱中，次日更换培养基。每 3-4 天更换一次培养基，当细胞生 长融合成片达 70-80%时，进行传代
10、，将处于对数生长期的细胞（第 3-6 代）用 于研究。Hoechst 33258 染色试剂盒购自碧云天公司，抑制剂 Z-IETD-FMK 购自 日本 MBL 公司。1.2 UVB 照射 当细胞生长至 70-80%融合时，弃去培养基，用温 PBS 冲洗两次，60加入适量 PBS，用 100，200，300 和 400mJ/cm2 UVB 照射，照射后立即将 PBS换成培养基，置 37 5%CO2 孵箱中孵育。1.3 MTT 法检测细胞活力 将皮肤成纤维细胞以每孔 5103 个细胞接种于 96 孔 板，当细胞生长至 70-80%融合时，将每孔中细胞的上清弃去，加入 80 ul PBS， 然后以 1
11、50mJ/cm2 UVB 照射，照射后立即将各孔中的 PBS 换成 150 ul 培养基，65置 37 5%CO2 孵箱中培养 48h。在实验结束前 4h，每孔中分别加入 20ul 5mg/ml MTT 溶液，孵育 4h 后吸除上清，各孔中加入 100 ul DMSO，室温振荡 15min， 使孔底部颗粒状物质溶解，之后在 490nm 酶标仪上比色，记录并比较 OD 值。1.4 Hoechst 33258 荧光染色法检测凋亡 将盖玻片置于 6 孔板中，种入细胞，使 约 80%融合时，使细胞照射 UVB，在照光后 48h 加入固定液，4固定过夜，PBS70洗细胞，再加入 Hoechst 3325
12、8 染色，PBS 洗细胞，将盖玻片置于有封片剂的载 玻片上，封片，每张玻片观察 5-10 个视野，记录并计算凋亡细胞数，凋亡细胞 百分比=凋亡细胞数(凋亡细胞数+正常细胞数) 100%。1.5 统计学分析 采用 SPSS16.0 软件进行分析，计量资料采用均数标准差（XSD）表示，作独立样本 t 检验；P0.05 认为有统计学显著性差异。752结果2.1 UVB 降低人皮肤成纤维细胞活力人皮肤成纤维细胞接受 100，200，300 和 400mJ/cm2 UVB 照射后 48h 细胞活力降低，而且随着照光剂量的增加，细胞 活性降低的更加明显（图 1）。80图 1 不同剂量 UVB 对人皮肤成纤
13、维细胞活性的影响*代表与正常对照组相比 P0.012.2 UVB 诱导人皮肤成纤维细胞凋亡皮肤成纤维细胞经上述剂量 UVB 照射 后，培养 48h 观察细胞，其中细胞核形态规则，发出均匀荧光的为正常活细胞； 可见浓染致密的颗粒状荧光和（或）明显核形变化的细胞为凋亡细胞；坏死细胞85不被染色。UVB 照射成纤维细胞后，在 48h 出现不同程度的细胞凋亡，照光剂 量越大，凋亡细胞数量和形态改变越明显（图 2）。90图 2 不同剂量 UVB 照射诱导皮肤成纤维细胞凋亡右下角 A、B、C 和 D 分别代表 100，200，300 和 400mJ/cm2 UVB 照射后细胞凋亡的图片，图中红色箭头 示凋
14、亡细胞核952.3 Caspase-8 抑制剂降低 UVB 诱导的细胞凋亡在照射 UVB 前 30 分钟，加 入 caspase-3 抑制剂（Z-IETD-FMK），使其终浓度为 20uM/L，然后使细胞照光， 在照射后 48h 观察细胞凋亡（图 3）。100105图 3 Caspase-3 抑制剂存在时 UVB 诱导皮肤成纤维细胞凋亡右下角 A、B、C 和 D 分别代表 100，200，300 和 400mJ/cm2 UVB 照射后细胞凋亡的图片，图中红色箭头 示凋亡细胞核2.4 UVBcaspase-8 抑制剂时凋亡细胞的比较100,200,300 和 400mJ/cm2UVB 诱导的皮肤成纤维细胞凋亡，在 48h 细胞凋亡数均较为明显；当存在 caspase-8 抑制剂时，在上述时间点细胞凋亡数有不同程度的下降，其比较结果 如下（图 4）。110115120125图 4 不同剂量 UVBcaspase-8 抑制剂时人皮肤成纤维细胞凋亡对比*代表在上述时间点 UVB 组和 UVB+Z-IETD-FMK 组比较 P0.053讨论人的皮肤包括表皮和真皮，成纤维细胞是真皮的主要组成细胞，也是紫外线 辐射的重要靶位，被紫外线照射后，皮肤成纤维细胞的生长、分化和细胞功能等 方面会出现明显的变化。1 在急性光损伤过程中，U
