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1、双重或多重免疫组化双重或多重免疫组化标记标记一一、基基本本原原理理 双双重重或或多多重重标标记记是是利利用用免免疫疫学学和和细细胞胞化化学学原原理理，在在同同一一张张切切片片上上同同时时采采用用或或先先后后采采用用不不同同颜颜色色的的荧荧光光色色素素或或酶酶促促产产物物，或或采采用用不不同同直直径径大大小小颗颗粒粒胶胶体体金金来来原原位位示示踪踪组组织织或或细细胞胞内内不不同同抗抗原原大大分分子子物物质质的的一一项标记染色技术。项标记染色技术。2双重或多重免疫组化标记 由由于于此此项项技技术术可可在在同同一一张张切切片片上上同同时时显显示示两两种种或或两两种种以以上上不不同同抗抗原原成成分分(
2、定定性性、定定位位、定定量量)，因因而而使使组组织织内内不不同同抗抗原原成成分分相相互互间间功功能能关关系系的的观观察察更更加加直直观观，操操作作需需遵遵循循的的原原则则和和要要求求基基本本上上与与单单标标免免疫疫组组化化方方法法雷雷同同，但但差差异异是是流流程程长长，脱脱片片机机率率更更高，前后重染色试剂间有交叉干扰等。高，前后重染色试剂间有交叉干扰等。3双重或多重免疫组化标记4双重或多重免疫组化标记5双重或多重免疫组化标记二、技术类型二、技术类型（一）双重或多重免疫荧光标记染色（一）双重或多重免疫荧光标记染色 采用呈现不同颜色的荧光色素配伍，采用呈现不同颜色的荧光色素配伍，分别标记不同的抗
3、体，再通过各自与同一分别标记不同的抗体，再通过各自与同一切片上的相应抗原特异性结合而加以区别切片上的相应抗原特异性结合而加以区别显示所建立起来的双重或多重免疫组化染显示所建立起来的双重或多重免疫组化染色技术。色技术。6双重或多重免疫组化标记 荧光素配伍荧光素配伍：异硫氰酸荧光素：异硫氰酸荧光素(FITC）翠绿色，常与罗丹明翠绿色，常与罗丹明(RB200)或异硫氰酸四甲基罗丹明（或异硫氰酸四甲基罗丹明（TRITC）配伍，）配伍，后者呈红色。后者呈红色。方法敏感、特异方法敏感、特异，需选用各自特定的，需选用各自特定的激发滤光片分别观察或二次曝光显影，激发滤光片分别观察或二次曝光显影，样样本不能长期
4、保存，组织结构背景不清晰本不能长期保存，组织结构背景不清晰。7双重或多重免疫组化标记 技术类型有技术类型有直接法和间接法直接法和间接法之分。前之分。前者特异、快速，后者敏感、多用。者特异、快速，后者敏感、多用。所用抗体试剂可为异种动物抗体，也所用抗体试剂可为异种动物抗体，也可为同种动物抗体。可为同种动物抗体。异种动物抗体常混合应用，操作步骤异种动物抗体常混合应用，操作步骤少，脱片率相对较低。少，脱片率相对较低。8双重或多重免疫组化标记 同种动物抗体多分别应用，操作步骤同种动物抗体多分别应用，操作步骤加倍，脱片机率相对较高，前后重免疫荧加倍，脱片机率相对较高，前后重免疫荧光标记交叉重叠机会多，需
5、用酸性洗脱或光标记交叉重叠机会多，需用酸性洗脱或多聚甲醛蒸气处理。多聚甲醛蒸气处理。9双重或多重免疫组化标记 操作举例：垂体腺瘤操作举例：垂体腺瘤-ACTH与与GH双重免疫荧光标记染色（间接法）双重免疫荧光标记染色（间接法）(1)石蜡切片，厚石蜡切片，厚5 m，常规二甲苯脱，常规二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，入蜡，梯度酒精水化，入PBS(pH7.4,0.01mol/L)。10双重或多重免疫组化标记(2)1人血清白蛋白（人血清白蛋白（HAS）孵育）孵育10min （亦可用（亦可用10正常羊血清代之），不洗。正常羊血清代之），不洗。(3)抗抗ACTH血清（血清（McAb）1:200，孵育，孵育 30m
6、in 37，湿盒。，湿盒。(4)0.05mol/L TBS(pH7.4,内含内含1 Triten 100,下同下同)洗，洗，10min3。11双重或多重免疫组化标记(5)羊抗鼠羊抗鼠IgG-TRITC 1:100，湿盒，室温，湿盒，室温避光反应避光反应1h。(6)0.05mol/L TBS(pH7.4)洗，洗，10min3，(第一重第一重ACTH-TRITC标记染色已完成标记染色已完成)。12双重或多重免疫组化标记(7)切片逐级酒精脱水，二甲苯透明，空切片逐级酒精脱水，二甲苯透明，空气干燥后，置于装有多聚甲醛粉末的密闭气干燥后，置于装有多聚甲醛粉末的密闭容器内，放在容器内，放在80烤箱或温箱内
7、以甲醛蒸烤箱或温箱内以甲醛蒸气固定气固定24h，使第一重染色中二抗的抗，使第一重染色中二抗的抗原结合部位失活。原结合部位失活。(8)切片以切片以TBS洗，洗，5min413双重或多重免疫组化标记(9)1 HSA（或（或10正羊血清）孵育正羊血清）孵育30min，室温，湿盒，不洗。，室温，湿盒，不洗。(10)抗抗GH血清血清(McAb)1:400，孵育，孵育30min，37，湿盒。，湿盒。(11)0.05mol/L TBS(pH7.4)洗，洗，10min314双重或多重免疫组化标记(12)羊抗鼠羊抗鼠IgG-FITC 1:100,湿盒，室温湿盒，室温避光反应避光反应1h。(13)0.05mol/
8、L TBS(pH7.4)洗，洗，10min3(第二重第二重GH-FITC标记染色完成标记染色完成)。(14)缓冲甘油封片。缓冲甘油封片。15双重或多重免疫组化标记(15)荧光显微镜下分别以荧光显微镜下分别以546nm及及490nm波长的激发光观察切片组织内波长的激发光观察切片组织内TRITC及及FITC所标示的所标示的ACTH及及GH抗原（抗原（TRITC阳性细胞呈红色，阳性细胞呈红色，FITC阳性细胞呈绿色）。阳性细胞呈绿色）。16双重或多重免疫组化标记(16)用彩色底片对切片同一部位用用彩色底片对切片同一部位用546nm及及490nm波长激发光分别作两次波长激发光分别作两次曝光，即可在同一
9、张照片上显示不同颜曝光，即可在同一张照片上显示不同颜色标示的色标示的ACTH与与GH两种抗原。两种抗原。17双重或多重免疫组化标记TRITC-GAMIgG鼠抗人鼠抗人ACTH（IgG）TITC-GAMIgG鼠抗人鼠抗人GH（IgG）T游离游离FabTTTFGH抗原抗原ACTH抗原抗原FFab被灭活被灭活图图1 同种动物抗体间接法（分步固定）双重免疫荧光荧色原理同种动物抗体间接法（分步固定）双重免疫荧光荧色原理18双重或多重免疫组化标记（二）双重或多重免疫酶标记染色（二）双重或多重免疫酶标记染色 以酶催化不同底物呈现不同颜色产物以酶催化不同底物呈现不同颜色产物标示同一切片内两种或两种以上抗原为理
10、标示同一切片内两种或两种以上抗原为理论基础所建立起来的多重免疫标记染色方论基础所建立起来的多重免疫标记染色方法。特点是光镜下可以同时观察和对比，法。特点是光镜下可以同时观察和对比，样品保存时间相对较长，一次曝光即可成样品保存时间相对较长，一次曝光即可成像，故较双重免疫荧光染色法更为常用。像，故较双重免疫荧光染色法更为常用。19双重或多重免疫组化标记 常用标记酶与底物的配伍常用标记酶与底物的配伍 单酶双底物单酶双底物-HRP-DAB(棕色棕色):4CN(蓝色蓝色)AEC(红色红色):4CN(蓝色蓝色)AP-萘酚萘酚AS-MX-坚固红坚固红(fast red 红色红色)-坚固蓝坚固蓝(fast b
11、lue 蓝蓝色色)20双重或多重免疫组化标记双酶双底物双酶双底物-HRP(DAB):AP(萘酚萘酚AS.MX-坚固蓝坚固蓝)HRP(4CN):AP(萘酚萘酚AS.MX-坚固红坚固红)（直接法、间接法、桥法均可使用，灵敏度（直接法、间接法、桥法均可使用，灵敏度以桥法中的复合物法最高，特异性则以直接以桥法中的复合物法最高，特异性则以直接法最佳）法最佳）21双重或多重免疫组化标记 操作方法类同单酶标记，有直接法、操作方法类同单酶标记，有直接法、间接法、复合物法之分。间接法、复合物法之分。间接法与复合物法较常采用。间接法与复合物法较常采用。操作举例操作举例 淋巴瘤轻链淋巴瘤轻链、的双重的双重酶酶标记标
12、记（双（双酶酶双底物）双底物）22双重或多重免疫组化标记(1)石蜡切片常规脱蜡进水（若用含汞固石蜡切片常规脱蜡进水（若用含汞固定液固定的组织则需用定液固定的组织则需用0.5%碘的乙醇溶液碘的乙醇溶液脱汞脱汞5min，乙醇浓度为，乙醇浓度为70，经自来水洗，经自来水洗后，以后，以2.5%硫代硫到钠浸洗硫代硫到钠浸洗1min，水洗，水洗)；(2)0.3%H2O2甲醇液浸泡切片甲醇液浸泡切片30min,自来自来水洗，蒸馏水洗水洗，蒸馏水洗,入入PBS(0.01mol/L pH7.2);23双重或多重免疫组化标记(3)滴加正羊血清滴加正羊血清1:10，湿盒，室温，湿盒，室温，10min，不洗；，不洗；
13、(4)加一抗加一抗(抗人抗人 PcAb与抗人与抗人McAb的混的混合液合液)1:200，湿盒，湿盒，37，45min或更或更长长；(5)PBS液，液，5min324双重或多重免疫组化标记(10)过氧化物酶显色反应：以过氧化物酶显色反应：以DAB-H2O2液显色液显色 710min(镜下控制显色程度镜下控制显色程度)，PBS洗，洗，5min3；(11)硷性磷酸酶显色反应：以萘酚硷性磷酸酶显色反应：以萘酚AS.MX及坚固蓝及坚固蓝(fast blue)显色显色1015min(镜下镜下控制显色程度控制显色程度)，PBS洗、自来水洗；洗、自来水洗；(12)缓冲甘油封片，光镜下观察缓冲甘油封片，光镜下观
14、察26双重或多重免疫组化标记PPPAAA 图图2 双酶双底物双酶双底物(复合物法复合物法)双重酶标染色原理双重酶标染色原理兔兔PAPGAR IgG兔抗兔抗KAg鼠鼠APAAPGAM.IgG鼠抗人鼠抗人27双重或多重免疫组化标记注注：若用同种动物抗血清分别进行标记染色时，：若用同种动物抗血清分别进行标记染色时，尚需考虑在前后重染色之间是否设置尚需考虑在前后重染色之间是否设置“多聚甲多聚甲醛蒸气处理醛蒸气处理2-4h（封闭固定）或用（封闭固定）或用pH2.2的甘的甘氨酸氨酸-盐酸溶液处理盐酸溶液处理2h（酸洗脱）的操作步（酸洗脱）的操作步骤骤”，目的为了避免前后重免疫试剂间的交叉，目的为了避免前后
15、重免疫试剂间的交叉反应。可视预实验结果来确定。反应。可视预实验结果来确定。28双重或多重免疫组化标记（三）双重及多重免疫金标记（三）双重及多重免疫金标记(电镜）电镜）电镜下的双重免疫标记染色不是靠电镜下的双重免疫标记染色不是靠颜色区分，而是靠标记物的不同电子密颜色区分，而是靠标记物的不同电子密度或颗粒的不同大小来区别不同抗原，度或颗粒的不同大小来区别不同抗原，有别于光镜下的双重免疫标记方法。有别于光镜下的双重免疫标记方法。29双重或多重免疫组化标记 常用的方法多为双重免疫金标记常用的方法多为双重免疫金标记 优点：优点：高电子密度，分辨率高，抗原定高电子密度，分辨率高，抗原定 位精确，颗粒大小可
16、人工控制，位精确，颗粒大小可人工控制，标记试剂易制备。标记试剂易制备。缺点：缺点：试剂质量要求高，非特异吸附干扰试剂质量要求高，非特异吸附干扰 大大(背景背景)30双重或多重免疫组化标记 类型有直接法、间接法（异种动物抗类型有直接法、间接法（异种动物抗体或同种动物抗体）体或同种动物抗体）-双面染色，分步双面染色，分步固定。标记用的胶体金颗粒，直径多采用固定。标记用的胶体金颗粒，直径多采用5nm,15nm组合，标记不同类别抗体组合，标记不同类别抗体(特异特异性一抗性一抗-直接法，间接抗体直接法，间接抗体-间接法间接法)。31双重或多重免疫组化标记 应用直接法进行多标，简便、快速、应用直接法进行多标，简便、快速、准确、效果佳，尤多用于细胞表面抗原的准确、效果佳，尤多用于细胞表面抗原的双重或多重标记。双重或多重标记。缺点：缺点：敏感性较低，金标抗体纯度要求高。敏感性较低，金标抗体纯度要求高。32双重或多重免疫组化标记 金标抗体双重抗原标记常用间接法显金标抗体双重抗原标记常用间接法显示，且多采用异种动物抗体混合同步操作。示，且多采用异种动物抗体混合同步操作。优点：优点：敏感性提高，操作步骤减少
