免疫学实验指导080410

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1、免疫学实验指导生命科学与工程学院生物工程、生物技术、动物医学专业用 冯玉萍分组：4人/组 ，实验用动物、器材以每组需要量设计班级 2006生物工程 、生物技术 学生人数：65人/58人 。 分16组/15组时间 2008年3月2008年7月 两周一次4学时。 目 录实验一、免疫学实验动物的一般操作实验二、实验动物免疫器官、免疫细胞观察实验三、实验动物的采血方法、动物血清及红细胞的制备方法实验四、淋巴细胞分离与E玫瑰花环形成试验实验五、IgG的分离和纯化实验六、玻片凝集试验(ABO血型鉴定)实验七、环状沉淀试验实验八、琼脂扩散试验（单向）实验九、巨噬细胞吞噬功能试验实验十、白细胞吞噬试验实验一、

2、免疫学实验动物的一般操作实验原理 实验动物的基本操作是免疫学实验的基础,抗原对动物机体的免疫效果，通过实验动物进行验证，因此必须掌握实验动物的一般操作技术。目的要求1、 实验材料的准备（棉球、注射器的准备与消毒）（演示）2、 了解免疫学实验常用动物的生物学特性、用途及其健康要求。自学3、 学习实验动物的编号、抓取、固定和几种不同的注射途径方法。4、 练习对小白鼠给药的几种不同途径的注射方法。5、 练习小白鼠的取血方法。6、学习血涂片的制作及染色；观察动物血液中有形成分的形态结构特点。 实验动物 小白鼠，2只/组，共需18 20只。试剂 3%来苏儿或3%石炭酸 100150 ml/组； 无菌生理

3、盐水100150ml/组；磷酸盐缓冲液2050ml/组（带滴管、染色用）。 3 5% 苦味酸2050ml/组（带滴管,编号用）； 5%品红20ml50ml/组（带滴管，编号用）； 瑞特氏（wrights）染色液50ml/组（带滴管，染色用）；*抗凝剂一支器材 1ml注射器及针头2支/组； 碘酒棉球、酒精棉球、无菌干棉球各适量； 手术剪刀2把/组；镊子2把/组；载玻片、盖玻片各6片/组； 毛细吸管2支、50100ml烧杯1个/组 显微镜6台/组6 鼠笼1个/组操作步骤1、练习小白鼠抓取、编号、皮下注射、皮内注射、腹腔注射的方法。（见免疫学实验P9-13。2、练习小白鼠尾静脉取血法。（P15）实验

4、报告要求：1、时间、地点、操作人、同组人、指导老师。2、实验原理、目的要求3、实验操作记录（实验步骤、结果）4、分析总结：依据实验原理、目的要求，分析总结实验是否成功，是否达到实验目的？为什么？5、对实验动物编号有何实际意义，你对书中关于小白鼠的编号方法有何想法？有无更简便、实用的方法？6、若给动物注射传染性材料应注意些什么？实验二、免疫器官与免疫细胞观察实验原理 免疫器官、免疫细胞是动物免疫系统的主体。在胸腺、脾脏中有大量淋巴细胞存在，在外周血液中有大量淋巴细胞和白细胞等免疫细胞存在，发挥着免疫监视作用。目的要求 1、练习血涂片的制作2、学习小鼠颈椎脱臼致死的方法，观察小白鼠的解剖结构；3、

5、学习脾脏、胸腺的触片制备与染色方法；观察小鼠脾脏触片、血液涂片中的免疫细胞，并画图。方法与步骤1、练习血涂片的制作（3张/组）1）准备一张洁净玻片，取血1滴于玻片右侧,另取一光边玻片的一端,放在血滴前方,并逐渐后移接触血滴,血液立即沿推片散开,然后将推片与载片保持30一45度角,平稳地向前推动,至玻片另一端,载玻片上便留下一层血膜。良好的血膜象舌头,头、体、尾鲜明,厚薄适宜、分布均匀,边缘整齐,两侧留有空隙。2）染色：A、瑞特氏(WrightFs)染色法：.血涂片制成后可在空气中挥动，使迅速干燥，以免血细胞皱缩。选择良好的血片，用特种玻璃铅笔画出两边界限(注意保留尾部，因体积大的细胞往往在此出

6、现)，以防染液外溢。在血膜上滴加几滴瑞氏染色液,左右晃动，使染液完全覆盖血膜，注意染液不宜过多而溢出界限，亦不能过少而干燥。12min后，滴加等量磷酸盐缓冲液或生理盐水，23min后，可见表面有金属光泽，即可用清水轻轻冲去染液，待血片自然干燥或用滤纸轻轻吸干。在正常的情况下，血膜外观染成粉红色。3）镜检：先在低倍镜下检查血片，染色是否合格，血细胞分布是否均匀等,然后换高倍镜或油镜观察，并绘图，指出淋巴细胞与白细胞、红细胞。如自己图片不成功，则对教学片进行观察和绘图。结果：血液涂片瑞特氏染色法染色的结果：中性粒细胞：是白细胞中数量最多的细胞，胞体大于红细胞，细胞核蓝紫色，呈分叶形，可分25叶。叶

7、间有细丝相连；细胞浆为粉红色，其中充满褐灰色的小颗粒。嗜酸性粒细胞：数量少，占白细胞总数的0.53%。胞体较中性粒细胞大，胞核蓝色，颗粒粉红色。嗜碱性粒细胞：细胞核蓝紫色，颗粒蓝色。红细胞数量最大，边缘厚（浓染），中央薄（淡）。淋巴细胞细胞质天蓝色，细胞核几乎占据整个细胞。B、姬姆萨染色法： 用甲醇固定标本10分钟，或醋酸：甲醇=1：3的混合液固定30分钟。 用滴管吸取姬姆萨染色工作液布满材料面，注意不要有气泡。 染色1015分钟后，用自来水冲洗，空气干燥，二甲苯透明5分钟。 用光学树脂封片后观察。结果：血液涂片姬姆萨染色法染色的结果：有核细胞的细胞核染成紫红色或蓝紫色，细胞浆染成粉红色。无核

8、细胞染成：C、血液标本片观察结果：2、练习小白鼠脊椎脱臼处死法。或用乙醚麻醉致死。 3、仔细解剖小鼠，观察小鼠的内脏器官，找出脾脏、胸腺，分别做触片（3张/组）并用瑞特氏(WrightFs)染色法或姬姆萨染色法染色、观察。4、观察标本片，绘图描述人、小鼠血液中的几种有形成分。结果1、脾脏触片瑞特氏染色法染色的结果：2、脾脏触片姬姆萨染色法染色的结果：3、标本片观察结果：实验报告要求：1、时间、地点、操作人、同组人、指导老师。2、实验原理、目的要求3、实验操作记录（实验步骤、结果）4、分析总结：依据实验原理、目的要求，分析总结实验是否成功，是否达到实验目的？为什么？5、绘图描述：人、鼠血液涂片中

9、的淋巴细胞、粒细胞、红细胞实验三、实验动物的采血方法、动物血清及红细胞的制备方法实验原理 抗原免疫动物后，其相应的抗体就会产生并存在于动物的体液中。血清是体液的重要组成部分，存在大量抗体。学会了制备血清的方法，就学会了制备抗血清的方法。 红细胞是免疫学反应中常用的颗粒性抗原，也是可溶性抗原的载体及补体结合反应中指示系统的组成成员。在许多免疫学检测中都要用到红细胞，因此，血清与红细胞的制备技术，是免疫学实验的基本技术。目的要求 1、 学习鸡、兔的动脉、静脉及心脏等部位的无菌采血方法；2、 学习动物血清、红细胞的制备方法；3、 掌握离心机的使用方法。4、 解剖鸡、兔，观察免疫器官。实验动物 鸡、兔

10、各1只/2组，共需鸡5只、兔5只。试剂 3%来苏儿或3%石炭酸 50 100 ml/组； 无菌生理盐水150ml/组；分两瓶（100ml/瓶、50ml/瓶） 500单位/ml的肝素溶液25ml/班。器材 10ml注射器及针头2支/组； 碘酒棉球、酒精棉球、无菌干棉球各适量；50-100ml烧杯1个/组； 手术刀、剪、镊子各1把/组； 50100ml、带玻璃珠的无菌三角烧瓶1个/组（可用20ml链霉素瓶代替）； 无菌试管及试管塞6套/组；离心管2支/组；（6）离心机1台/6组，共3台； 试管架1个/组、恒温培养箱一个/班、冰箱一个/班。 操作步骤1、兔耳静脉采血（P19）2、兔耳中央动脉采血（P

11、19）3、兔心脏采血：（P18）4、鸡翼根静脉取血（P19）5、鸡心脏取血（P18）。6、离心法制备血清：取下注射器针头将抽得的血液以无菌操作注入无菌的离心管中，平衡离心管，离心1020分钟/20003000rpm。用毛细滴管吸出血清，将获取的血清分装于已灭菌的小瓶内，加盖并用封口胶将瓶口封住，贴上标签注明血清的名称及制备日期，置低温冰箱中保存备用。7、沉淀法制备血清：取下注射器针头将抽得的血液以无菌操作注入无菌试管（或平皿）内，加盖置37温室内2小时，凝固后用无菌滴管沿试管（或平皿）边缘将血块与皿壁脱离，然后放入48冰箱中过夜，使血清充分析出。吸取血清分装于已灭菌的小瓶内备用。8、动物血红细

12、胞制备：(1) 无菌操作取静脉血，将血注入装有玻璃珠的无菌三角瓶中，振摇数分钟以脱纤维抗凝。(2)取适量的脱纤维血，用25倍无菌生理盐水洗2次，每次2000rpm，离心10分钟，弃上清后用无菌生理盐水配成20%的红细胞悬液，置4冰箱保存备用。作业：实验报告1、 简述无菌采血应注意哪些事项？ 2、 离心机操作中应注意哪些问题？3、血清制备中应注意哪些问题？ 4、红细胞制备中应注意哪些问题？备注：实验前请仔细阅读免疫学实验！ 实验四 血球凝集反应和交叉配血试验实验原理 红细胞等颗粒性抗原与血清中相应的抗体，在适量电解质存在的条件下，经一定时间后，凝集成肉眼可见的凝集物。抗原抗体的这种反应，称为凝集

13、反应。在人的ABO血型中，A型血的红细胞上有A抗原，血清中有抗B抗原的抗体；在B型血的红细胞上有B抗原，血清中有抗A抗原的抗体；故A型血的红细胞与B型血的血清混合时，在有电解质存在的条件下就可能发生凝集；同样，B型血的红细胞与A型血的血清混合，在有电解质存在的条件下也可能发生凝集；AB型血的红细胞上，既有A抗原，也有B抗原，而其血清中既无抗A抗原的抗体，也无抗B抗原的抗体；而O型血的红细胞上既无A抗原，也无B抗原，而其血清中既有抗A抗原的抗体，也有抗B抗原的抗体，故AB型血的血清与A型、B型、O型血的红细胞混合，均不会发生凝集，也就是说，AB型血的人能接受A型、B型、O型血液的输血；而O型血的

14、血清与A型、B型、AB型血的红细胞混合，均可能发生凝集；既O型血的人不能接受A型、B型、AB型血液的输血，但他却是万能输血者，其红细胞可以输给任何血型的人。兔、鸡是否也有相应的血型？尚不清楚。本实验可自行设计，在有生理盐水存在的条件下，利用不同组的兔与兔、鸡与鸡、鸡与兔的红细胞和血清的混合，观察凝集现象和溶血现象，并分析、总结实验结果。 目的要求 1、将实验三所制备的鸡、兔血清、红细胞分别进行交叉，自行设计，观察鸡与鸡、兔与兔、鸡与兔之间血清与红细胞交互混合，产生的凝集现象和溶血现象。 2、尝试着利用抗原抗体反应的特异性对实验结果进行解释。试剂 0.85%生理盐水，100ml/组；5ml注射器2支/组。器材 载玻片每人1张、小试管4支/组，毛细滴管2支/每组。操作步骤 1、将制备好的鸡、兔红细胞用生理盐水稀释成0.5%的混悬液。2、兔与兔（鸡与鸡）配血，观察血球凝集现象： 取1#兔（鸡）血清1滴于载玻片上，加入2#、3#兔（鸡）红细胞，用火柴棒混匀，过1015分钟，观察，血球凝集现象。3、兔与鸡（鸡与兔）配血，观察血球凝集现象 取1#、2#兔（鸡）血清1滴于载玻片上，加入1#、2#鸡（兔）红细胞，用火柴棒混匀，过1015分钟，观察，血球凝集现象。4、兔与兔（鸡与鸡