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1、实验一 色谱知识及气相色谱仪的使用实验目的1 了解色谱法的基本知识2 掌握色谱图的基本知识3 掌握气相色谱仪的结构、原理、操作方法4 掌握色谱定性、定量的基本方法实验原理色谱法(chromatography),是利用不同物质在不同相态的选择性分配，以固定相对 流动相中的混合物进行洗脱，混合物中不同的物质会以不同的速度沿固定相移动，最 终达到分离的效果，是一种利用混合物中诸组分在两相间的分配原理以获得分离的方法。 又叫“色谱分析”、“色谱分析法”、“层析法”，是一种分离和分析方法，在分析化学、有机化 学、生物化学等领域有着非常广泛的应用。按两相的状态分为气相色谱法(气固色谱法、气液色谱法)、液相
2、色谱法(液固色谱法、 液液色谱法)。按分离原理分为吸附色谱法、分配色谱法、离子交换色谱法、尺寸排阻色谱 法、亲和色谱法等，不同的分离方法其分离原理也不同。气相色谱法(gas chromatography)是用气体作为流动相的色谱法。气相色谱法由于所 用的固定相不同，可以分为两种，用固体吸附剂作固定相的叫气固色谱，用涂有固定液的担 体作固定相的叫气液色谱。按色谱分离原理来分，气相色谱法亦可分为吸附色谱和分配色谱 两类，在气固色谱中，固定相为吸附剂，气固色谱属于吸附色谱，气液色谱属于分配色谱。 在实际工作中，气相色谱法是以气液色谱为主。气相色谱系统由气源、进样口、色谱柱和柱箱、检测器和记录器等部分
3、组成。气 源负责提供色谱分析所需要的载气，即流动相，载气需要经过纯化和恒压的处理。气 相色谱的色谱柱一般直径很细长度很长，根据结构可以分为填充柱和毛细管柱两种。 柱箱是保护色谱柱和控制柱温度的装置，在气相色谱中，柱温常常会对分离效果产生 很大影响，程序性温度控制常常是达到分离效果所必须的。检测器是气相色谱带给色 谱分析法的新装置，在经典的柱色谱和薄层色谱中，对样品的分离和检测是分别进行 的，而气相色谱则实现了分离与检测的结合，随着技术的进步，气相色谱的检测器已 经有超过 30 种不同的类型。记录器是记录色谱信号的装置，现在记录工作都已经依 靠计算机完成，并能对数据进行实时的化学计量学处理。气相
4、色谱被广泛应用于小分 子量复杂组分物质的定量分析。色谱图基本知识：1色谱图(chroma to gram )样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号一时间曲线， 又称色谱流出曲线(elution profile ).2基线(base line)流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间 的流出曲线。一般应平行于时间轴。3噪音(noise)基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不 稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。4漂移(drift )基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动相 及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。5色谱
5、峰(peak)-组分流经检测器时相应的连续信号产生的曲线。流出曲线上的突 起部分。正常色谱峰近似于对称性正态分布曲线(Gauss曲线)。不对称色谱峰有两 种：前延峰(leading peak )和脱尾峰(tailing peak ).前者少见。6 保留时间：被分离样品组分从进样开始到柱后出现该组分浓度极大值时的时间，也 既从进样开始到出现某组分色谱峰的顶点时为止所经历的时间， 称为此组分的保留时 间，用Tr表示，常以分(min)为时间单位。7理论塔板数(theoretical plate number)： N色谱的柱效参数之一，用于定量表示色谱柱的 分离效率(简称柱效)。N取决于固定相的种类、
6、性质(粒度、粒径分布等、填充状况、柱 长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质。如果峰形对称并符合正态分布，N可 因此理论塔板数大的色谱柱效率高。当然，N的大小和柱子长度有密切关系：理论塔板高度 H=柱长/N,用H可以衡量单位长度的色谱柱的效率，H越小，则色谱柱效率越高。实验步骤1 气相色谱仪各部分结构及工作原理的介绍(1 打开高纯氮气的钢瓶，氮气吹色谱柱30分钟后，打开仪器，打开电脑，连接工作站。 设置氮气的总压力为0.5Mpa，氢气的压力为0.6Mpa,空气的压力为0.5Mpa。(2 气体系统、进样系统、分离系统、检测系统、柱温系统、记录系统等构造的介绍(3 工作原理的介绍2 操作方
7、法的介绍(1 样品预处理： 100mg 的甲醇溶于 100mL 的 60%乙醇溶液中。(2 工作站的介绍(3 )实验条件的设置：柱温：50C保持lmin,以10C/min升温，至120C。进样口温度：190C。检测器温度：200C。石英毛细管柱：填料聚乙二醇,3 色谱图的介绍(1) 用单次分析的方法进样0.5uL，记录色谱图。(2) 结合上面的色谱图,讲解部分色谱图术语。4 定性、定量方法的介绍( 1 )定性：以标品的保留时间为依据( 2)定量：内标法外标法数据处理及分析1. 定性：2. 甲醇的保留时间：峰面积：峰高乙醇的保留时间：峰面积：峰高：30m X 0.25mm X 0.5umo半峰宽
8、半峰宽：柱效率：分离度：理论塔板数：实验二 气相色谱法测白酒中甲醇的含量实验目的：1. 掌握气相色谱法检测白酒中甲醇含量的原理及方法2. 复习气相色谱仪的原理及操作方法3. 了解外标法定量的原理实验原理：根据甲醇等被测组分在气、液两相中具有不同的分配系数，于毛细管色谱柱中经气、液 两相作用，先后从色谱柱中流出，在氢火焰中电离检测。用保留时间定性、用内标法定量 实验用品：试剂：60%乙醇溶液、0.1g/100mL甲醇标准储备溶液仪器：气相色谱仪（岛津GC-14C）,氢火焰离子检测器、毛细管柱（聚乙二醇固定液0.25mmX30m,0.5um）、微量进样针实验步骤：1. 按仪器使用规则，打开机器。2
9、设置色谱条件：调整氢气的压力为60-80Mpa，空气的压力为50 Mpa，载气为高纯氮（三 99.999%）压力为400-600 Mpa,柱温初始温度为50C，保持1min,然后以20C/min程序 升温至150C，检测器温度200C，进样口温度190C。3溶液的配制：取甲醇标品0.1g（0.0001g）,用60%乙醇水溶液定容于100mL的容量瓶中， 摇匀，得到1mg/mL的标准储备液。取标准储备液0.2、0.4、0.6mL用60%乙醇水溶液定容 于100mL的容量瓶中，得到浓度为2.0、4.0、6.0ug/mL的标准溶液。3. 标准曲线的制作：按上述色谱条件，将标准溶液分别注入气相色谱仪，
10、得到色谱图。4. 样品的测定：按上述色谱条件将白酒试样注入气相色谱仪1 微升。根据保留时间确定甲 醇峰的位置，并记录甲醇峰的峰面积。连续进样三次，计算平均值。实验数据处理：1. 标准曲线：浓度2.04.06.0峰面积保留时间 TR=线性方程：相关系数：2. 样品中甲醇含量的测定a. 定性：b.宀日.定量：实验三 高效液相色谱法检测未知液中三聚氰胺的含量实验目的：1. 掌握高效液相色谱法检测乳制品中三聚氰胺的原理、方法2. 掌握高效液相色谱仪的原理、构造及使用方法实验原理：高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography, HPLC)是在经典液相 色谱
11、法的基础上，于60 年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色 谱法的区别是填料颗粒小而均匀,小颗粒具有高柱效,但会引起高阻力,需用高压输送流动 相，故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography , HPLC)。又因分析速度 快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography， HSLP)。HPLC 有以下特点：高压-压力可达150300kg/cm2，色谱柱每米降压为75kg/cm2以上高速- 流速为 0.110.0mL/min高效- 理论板数可达 10000 以上，在一根柱中同时分离成份可达
12、 100 种高灵敏度-紫外检测器灵敏度为0.01ng，同时消耗样品少HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：速度快-通常分析一个样品在1530min，有些样品 甚至在 5min 内即可完成分辨率高- 可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果灵敏度高- 紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器可达0.1pg柱子可反复使用-用一根色谱柱可 分离不同的化合物样品量少，容易回收- 样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或 做制备实验用品：高效液相色谱仪(岛津LC-20AT)、分析天平、超声波清洗器、甲醇、乙腈、氨 水、三氯乙酸、柠檬酸、辛烷磺酸钠、三聚氰胺标品、阳离子交换固相萃取柱实验步骤：1.
13、 仪器构造的介绍：1.1 高效液相色谱法分类：按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法(正相 与反相)、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。1.2 检测器：紫外检测器、示差检测器、电导检测器、荧光检测器、蒸发光检测器1.3色谱柱：查资料补全C181.4手动进样阀：查资料补全1.5高压泵：查资料补全1.6 流动相：查资料补全2. 使用方法的介绍Lcsolution 是我们的工作站。主要分成两部分：一部分是实时分析界面，用来进行试验数 据的获取；另一部分是再解析界面，用来进行数据的再分析。在实时分析界面，先设置实验条件，主要包括检测波长的设置、检测温度的设置、流动相比 例的设置
14、、流速的设置以及采集时间的设置。将设置好的条件另存为电脑的某一盘里，在达 到设置的试验条件后，仪器提示已ready,可以进样分析。点击工作站的单次分析，编辑内 容，点OK,将样品用0.22p m滤膜过滤后通过六通阀注入液相中，流动相由高压泵压入定 量环带着样品进入色谱柱进行分离，不同的化学成分在柱子中的保留时间不同，这些成分会 依次进入检测器，检测后流入废液缸中。屏幕上就会出现我们需要的色谱图，电脑自动积分， 算出每个峰的峰面积，在符合朗伯-比尔定律的基础上，与浓度呈现正比例关系，从而进行 定量分析。在再解析界面，可以对已经取得的色谱图进行解析，通过比较保留时间进行定性，通过绘制 标准曲线进行
15、定量。在报告模板处将每个样品的详细信息包括硬件配置信息、实验方法信息、 色谱图、峰表格信息等标示出来。3. 标准曲线的制作3.1色谱条件：C色谱柱（150mmX4.6mm,5p m）、流动相：离子对试剂缓冲液（柠檬酸和辛 18烷磺酸钠）-乙腈（90： 10）、流速：1.0ml/min、柱温：40C、波长：240nm、进样量：20M l3.2准曲线绘制：准确称取100mg的三聚氰胺标品用50%甲醇水溶液定容于100mL的容量瓶 中，得到 1mg/ml 的标准储备液，用流动相将三聚氰胺标准储备液逐级稀释得到浓度为0.8、 2.0、 20.0、 40.0、 80.0的标准工作液，按浓度由低到高进样检测，以峰面积浓度作图， 得到标准曲线回归方程。3.3 样品测定：在上述条件下，将样品进样检测，将样品中三聚氰胺的响应值带到标准曲线 上，进行定量。（超过线性范围则稀释后再进样分析）。实验数据处理：1.标准曲线的制作浓度线性方程相关系数r2三聚氰胺A2.未知样中三聚氰胺的含量：
