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1、2.2 内质网应激2.2.1 内质网及内质网应激概述内质网(endoplasmic reticulum, ER)是哺乳动物细胞中一种重要的细胞 器，其膜结构占细胞内膜的二分之一，是细胞内其它膜性细胞器的重要来源，在 内膜系统中占有中心地位。ER的功能包括：ER是细胞的钙储存库，内质网 的钙离子浓度高达5.0mmol/L，而胞浆中为O.lummol/L。并能调节维持细胞内 钙平衡。ER是分泌性蛋白和膜蛋白的合成、折叠、运输以及修饰的场所，ER 通过内部质量调控机制筛选出正确折叠的蛋白质，并将其运至高尔基体，将未折 叠或错误折叠的蛋白质扣留以进一步完成折叠或进彳丁降解处理。ER还参与固 醇激素的合
2、成及糖类和脂类代谢，内质网膜上含有固醇调节元件结合蛋白，对固 醇和脂质合成起调节作用。ER对影响细胞内能量水平、氧化状态或钙离子浓度异常的应激极度敏感。 当细胞受到某些打击(如缺氧、药物毒性等)后，内质网腔内氧化环境被破坏， 钙代谢失调，ER功能发生紊乱，突变蛋白质产生或者蛋白质二硫键不能形成， 引起未折叠蛋白或错误折叠蛋白在内质网腔内积聚以及钙平衡失调的状态，即内 质网应激(endoplasmic reticulumstress，ERS)。内质网巨大的膜结构为细胞 内活性物质的反应提供了一个广阔的平台，在许多信号调控中起到关键作用。最 近的研究表明，内质网是细胞凋亡调节中的重要环节39。ER
3、S可以介导与死亡 受体和线粒体途径不同的一条新的凋亡通路。当细胞遭到毒性药物、感染、缺氧 等刺激时，内质网腔未折叠蛋白增多和细胞内钙离子超载，引起caspase 12活 化，继而激活下游的caspase，导致细胞凋亡。早期的ERS是机体自身代偿的 过程，对细胞具有保护作用；如果这种失衡超过了机体自身调节的能力，最终的 结局将是细胞的死亡。ERS的确切机制目前尚不明确。深入研究ER及ERS,对于 完善细胞损伤和凋亡理博具有重要意义，有助于进一步认识疾病发生发展的机 制，为临床疾病预防和治疗提供新的理博依据。2.2.2 内质网应激的信号通路ER 内环境的稳态一旦被打破，将激活一系列的级联反应通路，
4、包括 PERK/eIF2a通路、IRE1/XBP1通路及ATF6介导的通路。内质网应激激活的信 号通路主要有40:未折叠蛋白反应(unfolded protein response， UPR)； 内质网超负荷反应(endoplasmicreticulum overload response, EOR)； 固 醇调节级联反应。其中UPR与EOR由蛋白质加工紊乱所致，固醇调节级联反应 由内质网表面合成的胆固醇损耗激发。(1) UPR：蛋白质在ER内的正确折叠需要许多分子伴侣的协助，当ER中未折 叠或错误折叠的蛋白增多时，应激信号通过内质网膜传递到细胞核，继而引起一 系列特定的靶基因转录和蛋白质翻译
5、水平下调，以使细胞继续存活，这种反应称 为未折叠蛋白反应(UPR)。UPR是一种细胞对抗内质网应激的自身保护机制，有 利于细胞内环境的稳定41。目前研究认为，UPR至少包括4种机制：I.减弱翻译能力，减少新蛋白合 成，防止未折叠蛋白进一步积聚；II.上调内质网分子伴侣等保护性基因的表达, 包括内质网伴侣蛋白GRP78和GRP94,谷胱甘肽等基因增强内质网蛋白折叠能力。 III.使核转录因子NFKB活化，提高内质网免疫调节和抗凋亡的能力。IV.诱导 细胞凋亡42, 43，当ER功能严重受累，机体以凋亡方式清除受损细胞以保护 器官的功能。UPR 是一种机体对抗 ERS 的保护机制，通过引发 ER
6、内未折叠或错误折叠蛋白 的正确折叠，以及调节细胞内钙浓度，来促使细胞功能恢复。但如果 ERS 过强 或时间过长，则将诱导细胞凋亡。IRE1、PERK、ATF6是内质网膜的三种起信号 转导作用的跨膜蛋白，它们均对腔内未折叠蛋白的聚集起作用44O IRE1和 PERK 是内质网膜上的跨膜蛋白激酶，在没有应激情况下，和 Grp78/Bip 形成稳 定的复合物，而当蛋白错误折叠或未折叠蛋白增多时促使 Grp78/Bip 与其解离， 然后IRE1和PERK的寡聚化及其自身磷酸化，刺激下游信号的激活。ATF6是 含有bZip转录因子结构域的II型跨膜蛋白。当未折叠蛋白在内质网聚集增多 时，ATF6向高尔基
7、体转位，被S1P (si te 1 pro tease )和S2P酶切成p50 bZip 转录因子到细胞核，并激活 XBPI 转录增加，导致 UPR 的活化。(2) EOREOR 是指正确折叠蛋白在内质网上过度积聚时引起的内质网超负荷，从而 导致一系列信号物质的激活，EOR也使机体自我保护性反应之一。EOR效应是激 活核转录因子NF kB。有研究显示，EOR能被抗氧化剂和钙拮抗剂所抑制；也 能被促使钙离子释放的药物所激活，因此推博 EOR 与钙储存释放以及活性氧产生有关45。（3）固醇调节级联反应内质网膜上含有固醇调节元件结合蛋白（SREBP）,其无活性的前体大分子与内 质网膜和核膜相连，在内
8、质网应激时内质网膜上的固醇耗竭，导致SREBP与内 质网膜和核膜结合的裂解，从而激活引导固醇生物合成的起动子，即固醇调节因 子，引起脂肪酸和胆固醇的合成增加46。内质网腔内未折叠蛋白增多或钙失衡， 引起内质网应激反应信号，经其膜上的三种跨膜蛋白激酶（IRE, PERK，ATF6） 传导到核内，使编码Bip等伴蛋白的基因表达增加，恢复蛋白质正确构像；eIF2 a磷酸化可抑制蛋白质翻译，减少蛋白质在内质网腔内的堆积，从而对细胞起 保护作用，但内质网应激反应时间过长或强烈可活化继而引起级联反应，导致细 胞凋亡。这是与死亡受体和线粒体介导细胞凋亡不同的一条途径。2.2.3 Caspase-12 的激活
9、与 ERS半胱天冬氨酸蛋白酶（ Cyst em e aspartat e sp e c i f i c prot e i nas e ， caspas e ） 是基因家族的表达产物，已发现这一家族至少有 14 个成员。这个家族包括一个 含有半胱氨酸的五肽结构，能在底物的 N 末端天冬氨酸残基处裂解底物，从而 通过蛋白水解激活或灭活底物蛋白对细胞凋亡起调节作用。caspase是执行细胞 凋亡的主要酶类，绝大部分细胞凋亡依赖于 caspase 的存在47。caspase 12 是 caspase 家族中较新的成员，也是这个家族中唯一定位于 ER 的成员，它的氨基端与 Caspase1 和 Casp
10、ase11 分别有 39%和 38%同源性。 caspase 12 高水平表达在肌肉、肾、肝组织中，在脑组织中有适当表达。Toshiyuki 等48将细胞破碎超速离心分为核、线粒体、微粒体（内质网膜）、 溶解碎片，经免疫组织化学和 western 印迹证实 caspase 家族中仅 caspase 12存在于内质网膜上。正常生理情况下，caspase 12以无活性的酶原形式存在。 内质网损伤可以特异地激活 caspase12 酶原，使 caspase12 发生重组，并与 其它内质网应激分子协同作用切割并激活 caspase9 酶原，继之裂解 caspase3 酶原等效应caspase，效应ca
11、spase切割多ADP聚合酶和其它细胞底物，最终 导致细胞凋亡的实现49。国外学者的研究发现，caspase 12在死亡受体或线粒体介导的凋亡途径中 不被活化。caspase 12 缺陷鼠能抵抗 ERS 引起的凋亡而其他死亡刺激仍可发生凋亡。这表 明 caspase 12 与 ERS 介导的凋亡密切相关，与不涉及 ER 的凋亡信号通路无 关38。因此Caspase 12被誉为是介导ERS致凋亡通路的关键分子。ERS 介导的细胞凋亡是不同于死亡受体及线粒体途径的一种新的细胞凋亡 途径，caspase 12作为凋亡起始因子发挥了关键的作用。有研究认为ERS时， 胞质中的caspase 7自身活化，
12、迁移到内质网膜上切割caspase 12前体，产生 活性 caspase 1250。活化的caspase 12易位至胞浆中，活化下游的caspase，导致细胞凋亡， 这个过程可被 caspase 12 的抗体阻断。caspase 12的激活主要通过以下几种方式51:钙蛋白酶（calpain） 的活化：calpain是胞质中另一类半胱氨酸蛋白酶家族成员，其活化依赖于钙离 子的存在，在ERS时，ER钙平衡打乱，细胞内钙离子水平升高引起calpain活 化，剪切定位于ER膜上的caspase 12前体，使之活化并释放入细胞质。TRAF2 依赖性机制：在非应激细胞中，TRAF2与caspase 12前
13、体形成稳定的复合物， 而发生ERS时，caspase 12前体与TRAF2分离，引起caspase 12活化。caspase 7的转位：ERS时使caspase 7移位至内质网表面，与caspase 12形成复合物， 并在Asp94和Asp341处切割caspase 12前体，破坏了膜与caspase 12的联系， 导致caspase 12活化并释放于细胞质。活化的caspase 12进而直接激活caspase 9,而caspase 9可通过裂解caspase 3酶原等效应caspase，切割多ADP聚合 酶和多种其它细胞内的底物，最终导致细胞凋亡。GRP78, caspase 7, casp
14、ase 12。复合物途径：最近研究表明52，ERS诱导伴侣蛋白GRP78表达并重新分布 于ER膜，与caspase 7和caspase 12形成复合物，阻止。aspase 12从ER释 放，ATP的加入可解离这种复合物并促使caspase 12向细胞质转位，进入细胞 质的活化的caspase 12启动ERS反应性凋亡级联反应，从而诱导细胞凋亡。在 此过程中，caspase 12起了关键作用。鉴于Caspase 12在内质网应激细胞凋亡 信号转导中的特殊位置，Caspase 12被认为是内质网应激引起细胞凋亡的一个 代表性分子53。2.2.4 ER的钙稳态ER是细胞内的钙储存库。钙离子是真核细胞
15、内重要的信号转录因子，广泛 存在于身体各种组织中，并参与体内众多重要的生命活动，钙稳态在细胞的正常 生理活动中起着举足轻重的作用。在哺乳动物细胞中，ER钙离子浓度高达5.0 mmol/L，胞浆中则为O.lummol/L。ER通过内质网膜上的IP3通道释放钙离子到 胞质中，通过钙泵将胞质中的钙摄入到内质网中，从而维持胞内钙的平衡55。 钙在内质网内以钙离子或钙结合蛋白的形式存在。而钙结合蛋白与蛋白质折叠及 修饰有关56, ER的分子伴侣和折叠酶大多数是强力钙离子结合蛋白。钙离子 作为信号转录因子，发挥两种作用：一是由内质网腔释放入胞质作为第二信使； 二是在内质网腔内调节钙依赖蛋白酶的活性。所以内
16、质网腔内钙离子的稳态对维 持细胞的功能至关重要。当内质网钙库受到严重干扰时，必然会影响这些蛋白质 的折叠和活性。研究表明，内质网钙稳态失衡是ERS的重要诱因。有研究显示内质网钙失衡诱导ERS发生时，激活calpain。活化的calpain 切割内质网膜上的caspase 12，产生活性caspase 12片断；calpain还可切 割bcl XL，使其失活。研究证明，将caspase 12前体与钙蛋白激酶一起在体 外孵育，能够产生caspase 12活性片断，从而导致细胞发生凋亡57Nobu hiro 等58将去除线粒体的小鼠成纤维细胞经Thapsi gargin处理诱导ERS，实验 结果表明，caspase 12活化启动caspase级联反应；caspase 12的底物是 caspase 9前体，并且caspase 9的活化不需线粒体释放细胞色素C；凋亡信 号从 caspase 12 传
