《人骨髓间充质干细胞体外成软骨诱导研究.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《人骨髓间充质干细胞体外成软骨诱导研究.docx（9页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、 人骨髓间充质干细胞体外成软骨诱导研究 【摘要】 目的： 研究人骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）在体外培养过程中的增殖和成软骨分化现象和规律。方法： 以密度梯度离心法分离健康成人髂骨MSCs，观察体外培养过程中细胞形态、生长和增殖现象。取第三代细胞给予地塞米松，维生素C和不同剂量转化生长因子1（transforming growth factor 1,TGF-1）行成软骨细胞诱导。3周后行阿利新蓝及甲苯胺蓝染色蛋白多糖，免疫荧光检测II型胶原，阿利新蓝比色法检测葡萄糖氨基聚糖。结果： 体外培养条件下MSCs生长旺盛。在TGF-1作用下MSCs向软骨骨细
2、胞分化，TGF-1 10 g/L组软骨细胞标志物表达最强。结论： MSCs有旺盛的增殖能力。MSCs在一定诱导条件下可以向软骨细胞分化，转化生长因子1（TGF-1）是诱导MSCs向软骨分化的关键性因素，10 g/L是其最佳诱导剂量。 【关键词】 骨髓间充质干细胞; 成软骨; 转化生长因子1 Abstract Objective: To research the phenomenon and rule of multiplication and chondrogenesis of mesenchymal stem cells(MSCs) derived from human bone marro
3、w in vitro. Methods： Healthy adults MSCs were isolated from Ilium and purified by density gradient. To observe the conformation, growth and multiplication of MSCs cultured in vitro. We chose the passage 3 MSCs and induced them into chondrogenic differentiation with Dexamethasone，Vitamin C and TGF-1
4、in different dosage formed chondracytes 3 weeks, we measured the sulfate glycosaminoglycan with toluidine blue and alcian blue, type collagen with immunofluorescence and glycosaminoglycan with alcian blue colorimetry. Results： MSCs can be cultured well in vitro. MSCs were induced into chondrocytes b
5、y TGF-1 and TGF-1 10 g/L group had the most evident expression. Conclusion： MSCs have strong ability of multiplication and could be induced into chondrocytes under certain circumstances. TGF-1 is the major factor of chondrogenesis while 10 g/L is the best inducing dosage. Key words mesenchymal stem
6、cells; chondrogenesis; TGF-1 各种由创伤和疾病引起的关节软骨缺损在临床上十分常见,目前临床上尚无有效的治疗方法。近年来组织工程技术的发展给修复关节软骨缺损带来了希望。最近的比较研究证实骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs)是修复全层软骨缺损的最佳细胞源1。笔者采集健康人骨髓，以密度梯度离心法分离人MSCs，行体外培养扩增及成软骨诱导，希望为临床治疗软骨缺损提供参考。 1 材料与方法 对象 骨髓标本取自3名健康成年男性自愿者（28，34，37岁）髂后上棘。3人均无全身性疾病和代谢性疾病。取得知情同意后，无菌条件下抽取骨髓5 ml置
7、于抗凝环境。 主要试剂 L-DMEM培养基（Gibco公司），类标准胎牛血清（民海生物公司），转化生长因子（TGF）-1（美国Peprotech公司），维生素C、地塞米松、胰蛋白酶、硫酸软骨素（Sigma公司），人淋巴细胞分离液Ficoll（天津灏洋生物公司），兔抗人二型胶原多克隆抗体、浓缩型Cy3-SABC免疫荧光试剂盒（博士德公司）。 人MSCs的分离和体外培养 取 ml骨髓加入等量PBS稀释，吹打混匀，贴壁缓慢加入已有5 ml Ficoll分离液的离心管。2 000 r/min离心20 min，吸取界面云雾状白膜层（富含MSCss）。加入PBS,800 r/min离心10 min洗涤2遍
8、，计数。以5106/cm2接种于细胞培养瓶，加入完全培养基（含10胎牛血清的L-DMEM培养基）。培养48 h后半量换液，弃去不贴壁的杂细胞。以后23 d换液1次，710 d即可见较多贴壁细胞。细胞90融合时胰酶消化，13传代培养。连续培养三代后MSCs基本纯化。取第三代细胞按1105/cm2接种96孔板，于传代后8 d内每天取10孔行MTT检测，绘制传代细胞生长曲线。 成软骨细胞诱导培养 配制成软骨诱导条件培养基号：完全培养基加地塞米松（10-8 mol/L）,TGF-1 （0， 5， 10， 20 g/L）、维生素C（10 mmol/L）。取长势良好的第三代MSCs，分4组（命名为A,B,
9、C,D）分别按1105/cm2接种于含条件培养基号的24孔板（每组12孔）。每日用倒置相差显微镜观察细胞形态。另取4个6孔板，按1105/cm2接种长势良好的第三代MSCs，分别用条件培养基号诱导培养3周，用以检测蛋白多糖（proteoglycan，PG）含量。 软骨细胞检测 定向诱导培养3周后，用4%低聚甲醛固定24孔板中细胞20 min后行以下检测。（1）甲苯胺蓝染色：用70%乙醇、浓度为%甲苯胺蓝染色1 min，再以95%的乙醇分色10 min，纯丙酮脱水2次，每次5 min，在倒置相差显微镜下观察细胞形态。（2）阿利新蓝染色：用pH 的阿利新蓝染色30 min，蒸馏水冲洗15 min，
10、100乙醇脱水，封固，在倒置相差显微镜下观察染色情况。（3）型胶原免疫荧光：各组取6片细胞玻片用3过氧化氢作用10 min灭活内源性过氧化氢酶，蒸馏水洗3遍，每次2 min；滴加山羊血清封闭液，室温10 min；甩去多余液体，滴加兔抗人型胶原IgG一抗，4过夜。第2天用PBS洗3次，每次2 min；滴加生物素化山羊抗兔IgG二抗，37孵育30 min；PBS洗3次，每次2 min；滴加SABC-Cy3，37孵育30 min；PBS洗4次，每次5 min；滴加Hoechst33342，37孵育15 min，PBS洗3次，每次5 min；封片，荧光显微镜下观察。（4）PG含量检测：蛋白酶水解6孔板
11、中定向诱导3周后的MSCs，超速离心提取葡萄糖氨基聚糖（glycosaminoglycan，GAG），以蒸馏水为空白对照，硫酸软骨素为标准品，阿利新蓝比色法2测定各板每孔GAG总量。 统计学方法 数据以均数标准差(xs) 表示,采用t检验分析组间差异。 2 结果 人MSCs的分离、培养和形态学观察 密度梯度离心法分离的人MSCs接种于培养瓶中时，倒置相差显微镜下可见满视野的小圆形悬浮有核细胞。静置于37，5CO2培养箱中48 h后半量换液，可见有少量贴壁细胞，多为梭形或成纤维细胞样，细胞形态幼小，细短。少数细胞呈扁平多角不规则形态。可见少量克隆样生长细胞，细胞排列不紧密，间距较大。 以后根据细
12、胞营养状态每23 d换液1次，细胞数量逐渐增加，细胞间排列逐渐紧密，出现小的细胞集落。部分细胞呈现出典型的长梭形和分支状。培养10 d后细胞间达到90汇集。消化后按13传代培养。传代培养7 d左右细胞可长满瓶底，细胞间排列紧密，呈漩涡状或编织样排列。连续传三代后细胞形态趋于一致，呈长梭形，细胞两端有长丝状伪足。 MSCs体外培养扩增的生长趋势 取第三代细胞接种96孔板，在培养的前8 d每天取10孔行MTT检测。生长曲线显示（图1）：接种后的前48 h内，细胞处于潜伏期，无明显增殖，细胞数量及密度变化不大，3 d后细胞开始扩增，35 d细胞增长较慢，5 d后扩增速度明显增加，57 d细胞数量快速
13、增加，排列逐渐规律，7 d后细胞增殖进入平台期。至8 d已长满孔底，细胞间排列规则紧密，呈编织样、鱼群样排列。 MSCs成软骨诱导过程中的形态学观察 前5 d细胞形态变化不大，仍保留MSCs典型的长梭形形态，但细胞增殖速度明显较未诱导状态下慢，9 d左右细胞数量约增加1倍。诱导第2周细胞逐渐变得宽大扁平，细胞核变大，胞质丰富，分支增加，有向多角形变化的趋势。后细胞继续向宽大扁平方向发展。 A组于诱导的第13 d出现透亮的圆形空泡状表现，后空泡数量逐渐增多，聚集成团，透亮折光强，形态酷似脂肪细胞（图2）。 图1 MSCs生长曲线（passage 3）（略） Fig 1 Growth curve
14、of MSCs（passage 3） 图2 A组细胞诱导第18天，空泡团明显（略） Fig 2 After 18 days of induction, group A hasclear vacuoles 甲苯胺蓝染色结果 A组为阴性胞质不着色。B组胞质染色很淡，无颗粒，细胞核着色，细胞和轮廓清晰。D组胞质染成均一的暗蓝色。C组为强阳性，胞核和胞质均染成深蓝色，细胞质染色更深，细胞轮廓清晰（图3）。 阿利新蓝染色结果 A组为阴性不着色。B组大多数细胞染成淡蓝色，细胞核不明显，少数细胞胞内有深染颗粒。D组细胞核轮廓可以分辨，胞质呈现天蓝色，细胞分支部分染色略淡。C组几乎所有细胞均染成浓蓝色，染色较D组深，细胞和轮廓明显，胞质内可见大块状深染部分（图4）。 型胶原免疫荧光结果 A组为阴性，B组荧光微弱。C,D两组细胞质中有红色荧光，细胞外也有细颗粒状淡染色荧光区域（图5）。 GAG含量检测 用标准硫酸软骨素C绘制GAG浓度-光密度（490 nm）标准曲线，求得直线回归方程。根据各孔光密度得到GAG含量。测得4组GAG含量分别为：（）g/孔、() g/孔、() g/孔、()g/孔。C,D组高于B组（P），C组高于D组（P）。B,C，D组均高于A组（P） 3 讨论 骨髓间充质干细胞（mesenchchymal stem cells，MSCs）是骨髓中一类来源于中胚层的具有自我增殖
