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1、RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP）限制性片段长度多态性，当用限制性内切酶切割不同品种或个体的基因组DNA时，如果限制性内切酶的酶切位点的碱基发生突变，或者酶切位点之间DNA片段发生碱基的插入或缺失，导致酶切片断的大小、数量发生了变化，产生相当多的数目和大小不等的DNA片段。这种变化可以通过特定的探针杂交进行检测，从而可以比较不同品种或个体之间的DNA水平的差异（或多态性）。广泛用于基因组遗传图谱构建、基因定位以及生物的进化和分类关系研究。RAPD（Random Amplified Polymorphism DNA, RAPD
2、）随机扩增多态性DNA，利用随即引物扩增寻找多态性DNA片段的分子标记方法。是建立在PCR技术基础上，利用一系列（通常数百）不同的随机排列碱基顺序的寡聚核苷酸单链（一般为10 bp）为引物，对所研究的基因组DNA进行PCR扩增，然后用凝胶电泳分开扩增片段，EB等染色剂染色后检测扩增产物DNA片段的多态性。与RAPD技术相类似的还有AP-PCR（Arbitrary Primed PCR）和DAF（DNA Amplified Fingerprints）2种标记技术。在AP-PCR分析中，所使用的引物较长（通常1050 bp），扩增分为3个部分，每个部分要求的条件和组分的浓度存在差异。DAF是一种改
3、进的RAPD分析技术，与RAPD技术不同的是它使用引物浓度更高，长度更短（一般58 bp），只有2个温度循环，并常用聚丙烯酰胺凝胶电泳，所提供谱带信息比RAPD大得多。AFLP（Amplified fragment length polymorphism，AFLP） 扩增片段长度多态性，AFLP是RFLP和PCR结合的产物，其基本原理是：将基因组DNA进行限制性内切酶酶切，然后选择特定的片段进行PCR扩增，使用双链人工接头与基因组DNA的酶切片段相连接作为扩增反应模板，接头与接头相邻的酶切片段的几个碱基序列作为引物的结合位点。这样就只有那些两端序列能与选择碱基配对的限制性片段被扩增，再在高分辨
4、力的测序胶上分开这些扩增产物。该技术的独特之处在于所用的专用引物可在不知道DNA信息的前提下就可对酶切片段进行PCR扩增。是目前一种十分理想有效的分子标记STS（Sequence-Tagged Site, STS）序列标签位点 是基因组上定位明确、作为界标并能通过PCR扩增被唯一操作的短的、单拷贝DNA 序列，用于产生作图位点，即测定一系列STS 的次序即可作出基因组区域的图谱。STS主要包括简单重复序列（Simple Sequence Repeat Polymorphisms, 简称SSR或SSRP）、锚定简单重复序列（ Anchored Simple Sequence Repeats, A
5、SSR）、序列特异扩增区域（Sequence-characterized amplified regions）、酶切扩增多态性序列（Cleaved Amplified Polymorphism Sequences, CAPS）、单引物扩增反应（Single Primer Amplification Reaction, SPAR）等标记技术。SSR (SimpleSequenceRepeats，SSR) 简单重复序列 真核生物的基因组中散布大量的串联重复序列，其中24个bp的微卫星序列具有高度多态性，微卫星在结构上的最大特点是两端序列较保守，因此可设计与两端保守序列互补的引物进行PCE扩增，来揭
6、示微卫星的多态性。SSR 是检测多态性的一种有效方法。SSCP（Single Strand Conformation Polymorphism, SSCP）单链构像多态性 是指相同长度的单链DNA因核苷酸序列的差异，甚至单个碱基不同，而产生的构像变异，在非变性聚丙烯酰胺中表现为电泳迁移率的差别。PCR产物变性处理，双链DNA分开成单链，再用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，根据条带位置变化来判断目的片段中是否存在突变。SSCP分析对DNA序列的改变非常敏感，常常一个碱基差别都能显示出来。SSCP结果判定是通过多个样品之间对比，观察条带之间位置改变，从而显示出不同生物个体的DNA特异性，达到指纹分析
7、的目的。该技术已被广泛用于癌基因和抗癌基因变异的检测、遗传病的致病基因分析以及基因诊断、基因制图等领域。SNP（Single Nucleotide Polymorphism, SNP）单核苷酸多态性 是指DNA序列上单个核苷酸的差异，是单个核苷酸置换产生的遗传标记。根据从STS中确定SNP位点的经验，每千个核苷酸会出现一个标记位点，因SNP的分布密集。检测SNP的最佳方法是DNA芯片技术，如果能将所有SNP全部信息载入DNA芯片，就可制造基因组扫描仪，用来扫描各个个体并分析它们在基因组成上的差异。SCAR(Sequence-characterized amplified regions) SC
8、AR标记是在RAPD技术的基础上发展起来的。目标RAPD片段克隆和测序，根据原RAPD片段两末端的序列设计特定引物进行PCR特异扩增。EST（expressed sequence tag，EST）表达序列标签 短的、单次（测序）阅读的cDNA 5或3端序列。也包括来自于差异显示和RACE实验的cDNA序列。一般是来自不同组织来源的cDNA序列，长度在300-500bp左右。Contig 重叠群或邻接片段 基因组测序中将许多序列片段经过比对找到重叠区，从而连接成长片段，这些片断称重叠连续群，简称重叠群。UniGene 被整理成簇的EST和全长mRNA序列，每一个代表一种特定已知的或假设的人类基因
9、，有定位图和表达信息以及同其它资源的交叉参考。SAGE（serial analysis of gene expression,），基因表达系列分析 是近几年来发展起来的一种快速分析基因表达水平信息的技术。它通过快速和详细分析成千上万个EST来寻找出表达丰度不同的SAGE标签序列，从而接近完整地获得基因组的表达信息。基因组学（Genomics），指对所有基因进行基因组作图（包括遗传图谱、物理图谱、转录本图谱），核苷酸序列分析，基因定位和基因功能分析的一门科学。基因组研究应该包括两方面的内容：以全基因组测序为目标的结构基因组学和以基因功能鉴定为目标的功能基因组学，又被称为后基因组（postgeno
10、me）研究。蛋白质组（proteome）指全部基因表达的全部蛋白质及其存在方式，是一个基因、一个细胞或组织所表达的全部蛋白质成分，蛋白质组学是不同时间和空间发挥功能的特定蛋白质群体的研究。蛋白质组学（protemics）。蛋白质组学是不同时间和空间发挥功能的特定蛋白质群体的研究。它从蛋白质水平上探索蛋白质作用模式，功能机理、调节控制、药物开发、新陈代谢途径等提供理论依据和基础。功能基因组学（Functuionalgenomics）又称为后基因组学（Postgenomics），它利用结构基因组所提供的信息和产物，发展和应用新的实验手段，通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能，使得生物学研究从
11、对单一基因或蛋白质得研究转向多个基因或蛋白质同时进行系统的研究。RNAi 和反义RNA RNA干扰(RNA interference，RNAi)是由双链RNA(double-strandedRNA，dsRNA)引发的转录后基因静默机制。 RNAi的机制可能是双链RNA进入细胞后，在Dicer酶的作用下，被切割成21-23 bp大小的小分子干扰RNA片段(small interfering RNAs，siRNAs)，siRNAs结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex, RISC）。激活的RISC可以精确降解与siRNAs序列
12、相同的mRNA，完全抑制了该基因在细胞内的翻译和表达。生物体内的双链RNA可来自于RNA病毒感染，转座子的转录产物，外源导入的基因。这些来源的双链RNA诱发了细胞内的RNAi机制，结果是病毒被清除，转座子的表达被阻断，外源导入基因表达被阻断同时，与其同源的细胞基因组中的基因表达也被阻断。由于少量的双链RNA就能阻断基因的表达，并且这种效应可以传递到子代细胞中，研究者们推测细胞内存在RNAi效应的扩增系统。研究者们发现，在真核细胞中也存在能以RNA为模板指导RNA合成的聚合酶（RNA-directed RNA polymerase，RdRP）。在RdRP的作用下，进入细胞内的双链RNA通过类似于
13、PCR的反应过程，呈指数级的数量扩增。双链RNA进入细胞后，一方面在Dicer酶的作用下被裂解成siRNA，另一方面在RdRP的作用下自身扩增后，再被Dicer酶裂解成siRNA。SiRNA的双链解开变成单链，并和某些蛋白形成复合物，此复合物同与siRNA互补的mRNA结合，一方面使mRNA被RNA酶裂解，另一方面以SiRNA作为引物，以mRNA为模板，在RdRP作用下合成出mRNA的互补链。结果mRNA也变成了双链RNA，它在Dicer酶的作用下也被裂解成siRNA。这些新生成的siRNA也具有诱发RNAi的作用，通过这个聚合酶链式反应，细胞内的siRNA大大增加，显著增加了对基因表达的抑制
14、。从21到23个核苷酸的siRNA到几百个核苷酸的双链RNA都能诱发RNAi，但长的双链RNA阻断基因表达的效果明显强于短的双链RNA。反义RNA (antisense RNA) 是一种本身缺乏编码能力,但能与特异靶RNA(主要是mRNA) 互补的RNA 分子,它可通过配对碱基间氢键作用与靶RNA 的特定互补区域结合形成双链复合物,抑制靶RNA 的功能,从而调控基因的正常表达。反义RNA 技术的基本原理是利用自然存在的或人工合成的反义RNA,通过基因重组技术反向插入到合适的表达载体形成重组DNA ,然后转染受体细胞,则这一反向插入的序列就会随细胞周期产生大量反义RNA ,对基因的表达进行调控,
15、从而抑制、封闭或破坏靶基因的表达。选择具有明显的生物学效应的靶序列后,反义RNA 即通过和相应的RNA 互补而达到阻断其功能的目的。YAC（yeast artificial chromosome，YAC） 一种能够克隆长达400Kb的DNA片段的载体，含有酵母细胞中必需的端粒、着丝点和复制起始序列。BAC (Bacterial Artifical Chromosome，BAC) BAC系统是基于大肠杆菌中可大容量容纳基因且稳定性良好的F因子衍生而来的载体系统，可容纳超过100kb的插入片段，BAC克隆的插入片段的平均长度为120kb，最大可达到240kb左右。良好的稳定性和操作的简便性是BAC
16、系统的主要优点。PAC（P1 bacteriophage artificial cromosome，PAC） PAC系统是以噬菌体P1为基础的克隆系统，它可容纳70100kb的插入片段，并可选择性地区分重组子和非重组子，且同时有两套复制机制。单拷贝复制子可用于稳定克隆增殖，而多拷贝复制子则可在Lac操纵子的控制下用于DNA的制备。CAP 分解代谢活化蛋白，是原核E. coli细胞内作用最强的基因调节物之一，是控制营养代谢有关的一套操纵子的激活蛋白。CAP通过结合cAMP而形成活化的CAPcAMP复合物，能结合到操纵子的启动子上或附近的特异CAP结合位点，帮助RNA聚合酶有效的结合到启动子上，提高形成封闭起始复合物的速度，从而提高了转录效率。CAP的作用位点在它调控的各种操纵子中都处于离开转录起始位点不同的距离。物理图谱 是DNA
