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1、考试资料word版2023年整理第一章 绪论课后习题答案1. 动物细胞工程主要有哪些内容？这些技术有何用途？答：1. 组织和细胞培养技术2. 细胞融合与单克隆抗体技术3. 细胞核移植技术4. 胚胎工程技术5. 干细胞技术6. 转基因技术7. 染色体工程细胞工程的应用有：A. 单克隆抗体的应用：疾病诊断与治疗、微量大分子物资的检测、贵重生物活性物的分离与提纯、特殊疾病治疗、与药物交联治疗疾病；B. 转基因技术的应用：建立疾病的动物模型、品种改良和抗病育种、“乳腺生物发应器”、基因代替治疗、异种器官移植、基因功能研究；C. 细胞与组织替代治疗；D. 治疗人类不孕症；E. 优良品种繁育；F. 生产转
2、基因家畜；G. 保护濒危动物。2. 追踪动物细胞工程研究与应用的最新进展，并预测其发展趋势。第二章 细胞培养1、体外培养细胞有哪些类型？其生长特点有什么区别？答：体外培养的细胞根据其生长方式，主要分为贴壁生长型细胞和悬浮生长型细胞。离体细胞必须贴附于底物上才能生长的细胞称为贴壁生长型细胞。有机体的绝大部分细胞必须贴附在某一固相表面才能生存和生长。动物细胞培养中，大多数细胞必须贴附在固相表面才能生长，当细胞布满表面后即停止生长。从生长表面脱落进入液体得细胞通常不再生长而逐渐退化，这种细胞称为单层附壁细胞。贴壁生长的细胞在活体体内时，形态各异，而体外培养状态下则在形态上比较单一而失去其在体内时原有
3、的特征。按照培养细胞的形态，主要可分为以下几类：成纤维细胞型、上皮型细胞、游走型细胞、多形型细胞；少数细胞类型在体外培养时不需要附着于底物而于悬浮状态下即可生长，包括一些取自血、脾或骨髓的培养细胞，如血液白细胞、淋巴组织细胞、某些肿瘤细胞、杂交瘤细胞、转化细胞等，这些细胞在悬浮中生长良好，可以是单个细胞或为细小的细胞团，观察使细胞呈圆形。由于悬浮生长于培养液中，因此其生存空间大，具有能够提供繁殖大量细胞、传代方便、易于收获细胞等优点，易于大规模生产，便于过程的控制。2、细胞系的生长过程包括哪些主要阶段？每一生长阶段各有什么特征？答：进行正常细胞培养时，不论细胞的种类和供体的年龄如何，细胞系的生
4、长过程都经历原代培养期、传代培养期和衰退期（或永生化）三个阶段。原代培养期也称初代培养期，即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续14周，此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛。原代培养细胞与体内原组织在形态结构和功能活动相似性较大，细胞相互依存性强。如把这种细胞群稀释分散成单细胞，在软琼脂培养基中进行培养时，细胞克隆形成率很低，即细胞独立生存性差。原代细胞生长一定时间后，如是贴附型细胞就会连接成片而铺满瓶底，这时需将原代细胞分开至多个新的培养瓶中，这个过程称为传代。初代培养细胞一经传代后便改称做细胞系。此期细胞增殖旺盛，可见细胞分裂相，并能维持二倍体核型。传代培养细胞与体内原
5、组织在形态结构和功能活动发生较大改变。一般情况下当传代1050次左右，细胞增殖逐渐缓慢，以至完全停止，细胞进入第三期。衰退期的细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；细胞形态轮廓增强，最后衰退凋亡。在细胞生命期阶段，少数情况下，在以上三期任何一点(多发生在传代末或衰退期)，由于某种因素的影响，细胞可能发生转化。转化的标志之一是细胞可能获得永生性或恶性。细胞永生性也称不死性，即细胞获持久性增殖能力，这样的细胞群体称无限细胞系，也称连续细胞系。3、每代细胞的生长曲线包括哪几个主要时期？各期细胞有何特点？答：每代细胞从开始接种到分离再培养，一般要经过以下阶段：潜伏期、指数(对数)生长期和停止期(平台期)。
6、细胞接种培养初期，历经悬浮、贴壁及生长加速的阶段。细胞接种培养 后，先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期。此时细胞胞质回缩，胞体呈圆球形。接着是细胞附着或贴附于底物表面上，称贴壁，贴壁出现标志悬浮期结束。细胞贴附于支持物后，会发生一系列变化，然后还要经过一个潜伏阶段，才进入生长和增殖期。细胞处在潜伏期时，可有生长活动，基本无增殖，少见分裂相。潜伏期后，细胞分裂出现，并逐渐增多，标志细胞进入指数生长期。又称对数期。此时细胞生长增殖旺盛，细胞成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。细胞分裂相增多。（细胞分裂相数量可作为判定细胞生长旺盛与否的一个重要标志。）在细胞数量达饱和密度后，细胞停止增殖，进
7、入停止期。此时细胞数量持平，故也称平台期。停滞期细胞虽不增殖，但仍有代谢活动，可继续存活一段时间。该时期细胞形态轮廓增强，最后开始衰退死亡。4、什么是原代培养与传代培养？原代细胞培养有哪些方法？各自的适用范围是什么？答：原代培养也称初代培养期，即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续14周。传代培养是指原代细胞生长一定时间后，如是贴附型细胞就会连接成片而铺满瓶底，这时需将原代细胞分开至多个新的培养瓶中，这个过程称为传代，初代培养细胞一经传代后便改称做细胞系。（课本55页）原代细胞培养的方法有：组织块培养法、单层细胞培养法、悬浮细胞培养法。组织块培养法特别适合于组织量少的原代培养；单层
8、细胞培养法尤其适用于细胞建系和大量组织的培养，用于少量培养工作时稍显繁琐；悬浮细胞培养法对悬浮生长的细胞如白细胞、骨髓细胞和胸水、腹水等癌细胞，可直接接种进行原代培养。5、常用的组织细胞分离方法有哪几种？答：分散组织的方法有机械法分离和消化分离法两种；根据组织种类和培养要求，宜采用相应的方法。(1). 机械分离法：A.离心分离法B.切割分离法C.机械分散法；(2). 消化分离法：A.胰蛋白酶消化法B.胶原酶消化法C.EDTA（螯合剂）消化法6、贴壁细胞传代时采用何种方法？其技术关键是什么？答：贴壁细胞传代时采用消化分离法，其技术关键是把握好传代时机，消化时间要适度，消化液浓度要适宜，传代的细胞
9、接种数量可适当多一些，使细胞能尽快适应新环境而利于细胞生存和增殖，部分贴壁生长细胞不经消化处理直接进行吹打也可使细胞从壁上脱落下来，而进行传代。7、常用的细胞克隆化方法有哪些？简述其主要技术环节答：主要方法有：稀释铺板法、饲养层克隆法、琼脂克隆法、毛细管克隆法、荧光激活分选法等。稀释铺板法：也称为有限稀释法。其原理是通过适当的稀释达到分离单个细胞的目的。将培养的细胞进行计数，用培养液进行稀释到510个细胞/ml后，在多孔培养板(一般为96孔板)各孔内分别加入细胞悬液0.10.2 ml，使孔内落入细胞的几率为每孔一个细胞。镜检每孔所含细胞数，标记含单个细胞的孔，培养一段时间后，凡在已标记的孔中有
10、生长增殖的细胞群即为克隆细胞。常规使用中，一般不进行镜检，多采用多次克隆化培养得到单细胞的克隆系。饲养层克隆法： 对一些生长缓慢的细胞(如杂交瘤细胞) ，单个细胞或密度极低时细胞难以存活和增殖，在培养皿中加入能贴壁生长的其他细胞（称为饲养细胞），这些细胞不仅能起到饲养作用，还能清除培养体系中的死、伤细胞及其碎片。饲养细胞的存在可以促进单个细胞生长为细胞克隆，达到克隆化目的。常用的饲养细胞有成纤维细胞、胸腺细胞和巨噬细胞。巨噬细胞不仅能起饲养作用，还能清除培养体系中死、伤细胞及其碎片。琼脂克隆法：将细胞培养在软琼脂形成的半固体培养基上，单个细胞可在半固体的培养基上增殖形成集落。常用的软琼脂法是在
11、培养皿中先铺一层0.5%的琼脂，待凝固后再铺一层0.25%的软琼脂，加入的细胞数要在几率上使长出的集落是一个细胞的后代。长出集落后，再转移到其他培养器中进行扩增分析。毛细管克隆法：毛细管克隆细胞法是最早的单细胞分离培养技术。其基本过程是：在倒置显微镜下，用弯头毛细管或借助显微操作仪将细胞逐个吸出，分别放入96孔板内培养形成克隆。本法虽比较精确，但过程较繁琐，成功率低，现已少采用。荧光激活分选法：将细胞标上荧光，当细胞悬液流经激活分选仪喷嘴时形成含有单细胞的液滴，细胞受激光照射发出荧光和前向散射光。通过仪器分析，使细胞带上电荷并使细胞流动方向发生偏移，各个含单细胞的液滴被分别收集在96孔板各孔内
12、，以达到克隆化的目的。8、常用的动物细胞大规模培养主要有哪些操作模式？各有哪些优缺点？答：操作模式：可采用分批式操作、流加式操作、半连续式操作、连续式操作和灌流式操作等多种操作方式进行培养。分批式操作：将细胞扩大培养后，一次性将细胞和培养液投入生物反应器内进行培养，在培养过程中其体积不变，不添加其他成分，待细胞增长和产物积累到适当的时间，一次性对细胞、产物、培养基进行收获，从中分离所需物质。该操作简单、培养周期短、污染和细胞突变的风险小，既能直观地反应细胞生长代谢的过程，又可直接放大，是进行动物细胞培养工艺条件研究常用的手段。流加式操作：细胞持续生长至较高的密度，整个培养过程没有流出或回收，细
13、胞或产物达到所需指标后终止培养，一次性回收整个反应体系，分离纯化产品。半连续式操作：培养物的体积逐步增加；可进行多次收获；细胞可维持指数生长，并可保持产物和细胞在一较高的浓度水平，培养过程可持续到很长时间。连续式操作：细胞维持持续指数增长，产物体积不断增长，可控制衰退期和下降期。其不足是，由于是开放式操作，加上培养周期较长，容易造成污染，在长周期的连续培养中，细胞的生长特性以及分泌产物容易变异，对设备、仪器的控制技术要求较高。灌流式操作：细胞截留系统可使细胞保留在反应器内，维持较高的细胞密度，提高产品的产量；连续灌流细胞使细胞稳定地处于较好的营养环境中，有害代谢废物得以及时清除；反应速率容易控
14、制，培养周期较长，可提高生产率，目标产品回收率高；产品在灌内停留时间短，可及时回收，有利于保持产品的活性。9、什么是细胞系、细胞株？答：细胞系 (cell line): 原代培养物经首次传代成功后即成细胞系。如果细胞系不能继续传代或传代次数有限，称为有限细胞系，它由原代培养中的许多细胞系列组成；如细胞系可连续传代，则称为连续细胞系，即已建成的细胞系 。 细胞株 (cell strain)：通过筛选或克隆化，且有特异标记的细胞，这些特性在以后的培养中必须持续存在。这些特性包括具有一定的标记染色体，对某种病毒的敏感性或抗性及具有特殊的抗原性等。10、动物细胞培养中常见的微生物污染有哪些？如何排除这
15、些污染？答：在组织和细胞培养中常见的微生物污染包括：细菌、真菌、支原体和病毒。细胞培养中用抗生素是杀灭微生物的主要手段，但迄今尚无对抗支原体特效抗生素，加温除菌法，动物体内接种除菌法，巨噬细胞吞噬法。第三章 细胞融合与单克隆抗体1、简述细胞融合技术的主要方法与技术原理。答：促细胞融合的方法有：病毒融合剂诱发细胞融合，化学融合剂诱发细胞融合，电融合法。细胞融合的基本技术：细胞融合实际上包含多个过程：首先是两个亲本细胞并列，以后膜组织局部破坏，最终形成包围融合细胞的连续胞膜。融合细胞表现的特征性变化，有膜成分和胞质成分的交流以及细胞内电导率的连续性。2、简述筛选融合细胞的主要方法与原理（各种方法的
16、原理？）。答：利用酶缺陷型、营养缺陷型、温度敏感性、形态和行为等标志，建立了多种选择选择系统，最常用的是酶缺陷型HAT选择培养法。酶缺陷型：将长期培养系突变为HGPRT或TK酶缺陷型的细胞系，在和正常细胞融合后，未经融合或自身融合的骨髓瘤细胞在HAT培养液中死亡；未融合或自身融合的正常细胞在体外生存能力有限最终也死亡。因此存活下来的只有融合细胞。营养缺陷型：营养缺陷型是指一些细胞在合成某些营养物上有缺陷，在缺乏必须营养物的培养基中难以生存。将不同营养缺陷型的细胞生成杂交细胞，这些细胞通过融合后基因互补得以在缺乏相应营养物的培养基中得以生存，而未融合细胞由于代谢受阻而死亡，由此可以将融合细胞分离出来。温度敏感性：培养的哺乳动物细胞可在3240之间的范围内存活（最适温度为37）
