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1、苦参碱对单核细胞源性泡沫细胞形成及PPAR，表达的影响 (一 )【摘要】目的 :观察苦参碱对诱导的单核细胞源性泡沫细胞内胆固醇脂和小凹蛋白表达的影响 .方法 :用荧光分光光度法测定胆固醇浓度;采用 TBARS法检测细胞内脂质过氧化产物；用油红 O 染色法检测泡沫细胞的形成；用荧光和 WesternBlot 检测的表达 .结果 :单核细胞经PMA 及 oxLDL 共同孵育后， 细胞内形成大量脂滴，胆固醇酯(CE)和细胞内脂质过氧化产物(MDA) 含量由 (3.4 0.6)mg/L,(0.430.07)nmol/L升至 (64.8 6.8)mg/L,(8.50 1.23)nmol/L(P0.，05
2、)泡沫细胞由 (4.7 2.2)%升至 (77.8 7.0)%(P0.05)，而和小凹蛋白蛋白表达由（4.4 0.）8 ,（ 0.5 0.09） ,（0.6 0.09）降至（ 1.6 0.）4 ,（ 0.33 0.09） ,（0.33 0.09） (P0.05)，苦参碱低、中、高干预组细胞内积聚的CE和MDA含量分别为(29.7 4.9)mg/L,(1.92 0.46)nmol/L,(5.8 1.3)mg/L,(0.6 0.08)nmol/L,(3.4 0.6)mg/L,(0.43mol/L; 泡沫细胞为和小凹蛋白蛋白表达为（ 6.4 2.）2 ,（ 0.6 0.08） ,（ 0.5 0.09
3、） ,（ 7.4 2.）2,（ 0.6 0.08） ,（ 0.6 0.07） ,（8.6 2.）7 ,（ 0.6 0.06） ,（ 0.7 0.06），与组比较有显著性差异(P0.05).结论 :苦参碱减少诱导的单核细胞源性泡沫细胞的形成及细胞内胆固醇聚集，增加泡沫细胞内小凹蛋白的表达 .【关键词】苦参碱;泡沫细胞 ;过氧化增殖物激活型受体胆固醇 ;小凹蛋白0 引言动脉粥样硬化一个重要的特征是单核细胞进入损伤的动脉壁进而分化为巨噬细胞.这些巨噬细胞吞噬大量的脂质变为泡沫细胞1.在人类和小鼠粥样斑块损伤中可见过氧化物酶增殖物激活受体明显表达，提示在动脉粥样硬化中起重要作用.小凹蛋白具有结合和运载
4、胆固醇的功能,并促进细胞内游离胆固醇流出,对维持正常细胞胆固醇的稳态起着重要调节作用 2.苦参中的活性成分苦参碱 （ Matrine ）具有较为广泛的生物学作用 3.但其抗动脉粥样硬化的机制目前尚不清楚.本实验我们以诱导的单核细胞形成的泡沫细胞为实验模型,观察苦参碱对胆固醇脂,PPAR,小凹蛋白表达的影响，进一步探讨苦参碱在动脉粥样硬化发病机制中的作用.1 材料和方法1.1 材料1640 培养基购自 GIBCO公司；胎牛血清购自天津市正江高科技有限公司；牛血清白蛋白 (BSA),佛波酯（ PMA）,油红 O,靛蓝胭脂红 ,胆固醇氧化酶 ,胆固醇酯酶均购自Sigma 公司；胆酸钠美国 Amres
5、co 公司 .胆固醇购自 GourMetCellApplication 公司；苦参碱 (一种生物碱 ,具有四环的喹嗪啶类结构，熔点 75.577.5 ,纯度 99%,溶于水 ),批号为 20040625，分子质量 248.36，宁夏中药厂提供 .1.2 方法健康人血浆购自宁夏中心血站，按照常规方法分离、提纯，提取的LDL 以含 0.1g/LEDTA 的缓冲液 (pH7.6)4透析 48h,过滤除菌 ,考马斯亮蓝法定量蛋白 .在分组干预时，使苦参碱终浓度达到以下分组的浓度 4： 对照组：对细胞没有任何干预；组：培养细胞中加入终浓度为0.5mg/L 的 PMA,100mg/L 的苦参碱低剂量组：培
6、养细胞中加入终浓度为0.5mg/L 的 PMA,100mg/L 的-4mol/L 的苦参碱； 苦参碱中剂量组：培养细胞中加入终浓度为0.5mg/L 的 PMA,100mg/L的-4mol/L的苦参碱； 苦参碱高剂量组：培养细胞中加入终浓度为0.5mg/L的 PMA,100mg/L 的-3mol/L的苦参碱，各组继续培养 48h.按文献 5用荧光分光光度法测定各样品的胆固醇浓度，测定游离胆固醇时，反应液中省去胆固醇酯酶， 胆固醇酯的含量用总胆固醇与游离胆固醇的差值获得.按照 MDA 测定试剂盒说明书的方法，检测MDA色.400 倍光镜下非重复计数取总RNA，提取的RNA的含量及活性.显微镜下观察
7、，细胞内脂质呈红色，细胞核呈蓝100 个细胞，计出泡沫细胞所占的数量.按 Trizol 试剂盒说明书提溶于适量DEPC 水中，备用. 逆转录总反应体系为50L,总RNA10 g,oligdT2混匀L,短暂离心,70预变性10min, 冰浴5min; 加入MMLV逆转录酶2 L,RNasin1 L,dNTP2 L,MMLV缓冲液 10 L40逆转录 60min,94 5min 灭活逆转录酶 .荧光定量 PCR引物序列资源自 GenBank 序列数据库 .根据基因的相对量 =2- Ct，在该公式中， Ct是热循环仪检测到反应体系中荧光信号的强度值， Ct= CtGI（待测样品） -CtGAPDH（
8、待测样品）- CtGI（校正样品） -CtGAPDH（校正样品） .GI 是目的基因，校正样品是任何被选做代表 1 倍目的基因表达量的样品， 使用这一方法可以直接得到目的基因相对于管家基因的定量 .按文献方法6 ,待测样品用BCA 试剂测定蛋白含量后蛋白浓度以BCA 法测定 .采用软件分析测定其区带的感光密度,以 actin为内参照 ,用目的片段与 actin的光密度比值表示蛋白质表达水平.统计学处理 :各样本测定值以xs表示，行方差分析(ANOVA)及多样本均数的两两比较(LSD).组间方差不齐时,采用非参数秩和检验,用 SPSS11.0统计学软件进行分析,P0.05 为差异有统计学意义 .2 结果2.1 苦参碱对激活的人单核细胞内胆固醇积聚及脂质过氧化的影响经处理后单核细胞内TC,FC,CE及 MDA 的含量均增加（P0.05），苦参碱可减少所致的单核细胞内TC,FC,CE及 MDA 的含量的增加（P0.05），但苦参碱低剂量组仍高于对照组(表 1).表 1 各组人单核细胞内胆固醇的积聚及脂质过氧化产物的比较(略)
