微生物检验技术师考点

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1、 1.仪器的标识管理：红（停用）黄（准用）绿（合格）各自所说明的状态。2.分光光度计检测细菌浓度用可见光分光光度计，测细菌波长用。检测蛋白用紫外分光光度计（波长用），它也可测核酸浓度（波长）。选定分光光度计测定颜色反应光的波长是。石英比色皿用于紫外分光光度计，玻璃比色皿用于可见光分光光度计。 3紫外透射仪 该仪器使用条件是暗室和紫外线，主要用于在紫外线下看条带。 4色谱气相色谱可做微生物分类和鉴定，用于微生物的化学成分分析。液相色谱仪也可做微生物化学成分分析。质谱仪也可做微生物化学成分分析。 5测序仪蛋白测序仪测定氨基酸排列顺序，测序仪是测核苷酸排列顺序。能做测序的物质是质粒、噬菌体、产物。

2、6扩增仪 是聚合酶链反应缩写，能做称扩增仪。它能以一定片段为模板，变换温度，扩增该片段。常用的“枪”是实验室常用的微量可调移液器。 7酶标做的仪器称酶标仪，做反应，其中主要设备有塑料凹孔板、洗板机和酶标仪。8.电泳类别 醋酸纤维膜电泳可用于免疫球蛋白鉴定，琼脂免疫电泳用于蛋白分离和鉴定，对流免疫电泳可测抗原或抗体，火箭电泳测抗原量，交叉定量免疫电泳测抗原量。是等电聚焦电泳。是脉冲电场凝胶电泳，是聚丙烯酰胺凝胶电泳。9. 用于蛋白和核酸分离，原理是凝胶介质形成立体多孔网状结构，具有分子筛和电泳作用。分离条带上边是大分子，下边是小分子物质。过硫酸铵在制备起催化聚合作用。是十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝

3、胶电泳，它用于蛋白分离，在此电泳中，丙烯酰胺浓度越大，线性分离围越小；该物浓度越小，线性分离围越大，十二烷基硫酸钠作用是解离蛋白，用标准蛋白做标识测验电泳条带分子量。在中常用蛋白染料是考马斯亮蓝，硝酸银也是其常用染料。该电泳中缓冲液重要成分为甘氨酸。 10、等电聚焦电泳 其原理是以两性电解质制造凝胶有不同，使带不同电荷的多肽在电泳条件下于等电点停留。 两性电解质是制备该电泳凝胶不同重要物质，用聚丙烯酰胺制备等电聚焦电泳凝胶。这种电泳主要用于蛋白质分离。 11、脉冲电泳 脉冲电泳用于核酸分离，其优点是分离大片段核酸。用琼脂糖制备该电泳凝胶的介质。这种电泳的电场为正交的交变脉冲电场。脉冲电场凝胶电

4、泳条带靠近负极为大片段，靠近正极为小片段。染色可用溴化乙锭，也可用硝酸银。因溴化乙锭有致癌作用，故在使用时应注意。丙烯酰胺具有神经毒，在用时注意个人防护。 12、琼脂糖凝胶电泳 此电泳用于核酸分离与纯化，用水平电泳槽。分离片段最正确围为。13、聚丙烯酰胺电泳 该电泳通常用垂直电泳槽，分离片段是最正确围是。 14.中华人民国国家标准GB 19489-2004实验室生物安全通用要求根据生物因子对个体和群体的危害程度将其分为4级： 危害等级（低个体危害，低群体危害）不会导致健康工作者和动物致病的细菌、真菌、病毒和寄生虫等生物因子。 危害等级（中等个体危害，有限群体危害）能引起人或动物发病，但一般情况

5、下对健康工作者、群体、家畜或环境不会引起严重危害的病原体。实验室感染不导致严重疾病，具备有效治疗和预防措施，并且传播风险有限。 危害等级（高个体危害，低群体危害）能引起人或动物严重疾病，或造成严重经济损失，但通常不能因偶然接触而在个体间传播，或能用抗生素抗寄生虫药治疗的病原体。 危害等级（高个体危害，高群体危害）能引起人或动物非常严重的疾病，一般不能治愈，容易直接、间接或因偶然接触在人与人，或动物与人，或人与动物，或动物与动物之间传播的病原体。15.保存的病原微生物菌（毒）种要按规定进行登记、上报和核准，实行双人双锁管理和使用审批制度。 保存和使用各类病原微生物菌（毒）种的实验室，应具备相应的

6、实验室设备和设施条件，并在二级以上生物安全柜中操作。细菌实验室在污染情况超过许可程度时，通常采取甲醛熏蒸消毒。病毒篇 1.用于病毒分离的材料，无论是传代病毒培养物，还是采自发病或死亡动物的病料，都应尽快送往实验室作病毒分离或鉴定。组织细胞或动物接种和传代可以应用于病毒的分离和鉴定。病毒对细胞的感染性具严格的选择性和特异性，因此用组织培养细胞接种病毒必须首先选择敏感细胞。 （1）病毒增殖的判定：病毒在实验动物体和组织培养细胞增殖，显然都会影响机体和细胞的代和生命活动，并且经常通过一定的形态学和病理学变化表现出来。 （2）细胞病变（CPE）：大部分病毒在敏感细胞系均可出现CPE，CPE可以表现为严

7、重的细胞破坏、细胞肿大、颗粒增多、细胞融合成合胞体或无明显的细胞变化等。CPE经常具有病毒“种”的特性，因此常常作为病毒鉴定的依据之一。（3）病毒蚀斑（又称空斑）技术：病毒蚀斑是指病毒在已长成的单层细胞上形成的局限性病灶，主要用于病毒的纯化或病毒悬液中感染病毒含量的测定。（4）病毒感染力的滴定：常用的病毒感染力的滴定有两种方法，一种方法是用实验动物测定LD50（半数致死量），另一种方法是在组织细胞上测定TCID50（半数细胞培养物感染量）。（5）病毒的保存：分离或鉴定后的病毒经过冷冻干燥后可以长期保存。 2病毒形态学检查 快速有效的标本制作技术故然重要，但更需要识别病毒结构的经验。病毒形态学检

8、查方法主要有： （1）光学显微镜 仅用于大病毒颗粒（如痘类病毒）和病毒包涵体的检查。 （2）电子显微镜检查法 （3）超过滤法 用不同孔径的火棉胶滤膜过滤病毒悬液，将获得的滤液接种于组织细胞、实验动物或鸡胚，或用血凝试验来测定病毒是否通过滤膜，从而估计病毒的大小。 （4）超速离心法 根据病毒大小的不同，其沉降速度也不同。可用超速离心法测得病毒的沉降系数（S），借以计算病毒的大小。 （5）X线晶体衍射法 但标本必须为结晶，可用于无包膜病毒的研究。3免疫学鉴定 4病毒的分子生物学鉴定 分子生物学诊断的特异性取决于核酸序列的特异性，病毒的分子生物学鉴定，包括对病毒核酸和蛋白质的测定。 核酸测定主要使用

9、聚合酶链反应技术、探针技术和核酸序列测定，检测病毒基因组中的特征性区段甚至整个病毒基因组；而蛋白质测定可使用免疫测定技术、电泳技术和质谱技术，检测病毒特异的蛋白质成分。 实验动物、鸡胚以与体外培养的器官和细胞都可以作为人工增殖病毒的基本工具。而大量病毒的培养，又是病毒学实验研究以与制备疫苗和特异性诊断试剂的先决条件。 1组织培养 组织培养用的玻璃器皿要求比较严格，要用硫酸和重酪酸钾溶液浸泡后再清洗应用。 常用的人工综合营养液为MEM和RPMI1640。用人工综合营养液配制细胞生长液时需要加入适量血清和谷氨酰胺溶液，还需要加入规定量的抗生素溶液防止细菌污染，加人碳酸氢钠溶液修正pH，根据情况还可

10、加入HEPES溶液可使生长液具有较强的pH缓冲能力。能使组织和成片细胞分散成单个细胞的化学制剂为胰蛋白酶和EDTA，EDTA使用液又可称之为Versen溶液，其分散细胞的作用原理是EDTA可以结合钙、镁离子，使组织细胞分散。动物血清中具有细胞生长所必需的各种营养因子，它能促进细胞的贴壁和生长，且有很强的酸碱缓冲能力。细胞培养液在细胞培养过程中可分为细胞生长液和细胞维持液两种。生长液是使细胞发育增殖的液体，因此要求营养条件丰厚；维持液用于延缓细胞代，从而延长细胞的存活时间，以利于实验的进行。这两种液体成分的主要区别是血清含量不同。细胞生长适宜的pH围是pH7.27.6。细胞培养技术全过程的关键是

11、防止污染。2细胞株的保存 二甲基亚砜是细胞低温保存的良好的保护剂，含10二甲基亚砜的血清可以作为悬浮细胞的液体在液氮中保存细胞。 3. 病毒学上常用的细胞类型可分为原代细胞、二倍体细胞和传代细胞三大类，原代细胞培养和传代细胞培养的根本区别在于细胞是否能在体外无限传代。 4. 细胞的纯化 细胞的纯化可以用细胞克隆技术。克隆是指用无性繁殖方法产生的一组遗传上相同的细胞和生物群体的过程。 分子杂交，常规的细菌筛选和各种杂交时多项选择用硝酸纤维素滤膜作为固相支持体。 （1）Southern杂交 被检对象为DNA，探针为DNA或RNA。 （2）Northern杂交 被检对象为RNA，探针为DNA或RNA

12、。 PCR (聚合酶链式反应)反应包括三个基本步骤，即：模板DNA的变性、模板DNA与引物的退火复性、引物的延伸。PCR反应体系包括5种基本成分，依次为：引物、DNA聚合酶、dNTP、模板DNA、Mg2+。 1、 引物 引物是PCR 特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。设计引物应遵循以下原则：引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。 引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。 引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核

13、苷酸 的成串排列。 避免引物部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。 引物3端的碱基，特别是最末与倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR 失败。 引物中有或能加上适宜的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子 克隆很有好处。 引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。 引物量： 每条引物的浓度0.11umol或10100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好。 2、 酶 目前有两种Taq DNA聚合酶供应， 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的

14、基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。 3、 dNTP dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，在PCR反应中，dNTP应为50200umol/L， 4、模板 模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀;蛋白酶K能水解消

15、化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止Rnase降解RNA。5、Mg2+浓度Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.52.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少。基因芯片也称为基因微阵列技术，指采用