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1、浅论中药复肝春6号体外诱导小鼠肝癌H22细胞凋亡实验研究【摘要】 目的：探讨中药复肝春6号是由河北省中医院毛宇湘副主任医师根据多年临床经验拟定的，由黄芪、女贞子、牡蛎、鳖甲、莪术、白花蛇舌草、薏苡仁、半枝莲、桔梗等中药组成。方中黄芪、女贞子补气养阴，扶正固本；白花蛇舌草、半枝莲、薏苡仁清热解毒，软坚散结；莪术、桔梗理气活血，消肿散积；诸药合用，可共奏益气养阴，清热解毒，健脾利湿，软坚散结之功。临床试验发现此方剂对减轻中晚期肝癌患者的痛苦，延长患者生存期、提高生活质量有明显的效果。本研究目的是通过观察FGC6对体外培养H22细胞增殖的抑制作用以及肝癌细胞凋亡的生化及形态学变化，从细胞、分子水平探
2、讨该方药抗肝肿瘤作用的机制，旨在为其临床应用提供实验依据。 1 材料与方法 细胞株 小鼠肝癌细胞株由河北医科大学实验动物学部实验动物研究室提供。药物 FGC6方剂中各单味中药均购自乐仁堂大药房，配伍后，以蒸馏水浸泡1h，水煎两次后混匀，过滤并浓缩，置于4冰箱储存备用。氟尿嘧啶注射液(5Fu)：上海旭东海普药业有限公司生产，产品批号为051104。主要仪器及试剂 低温冰箱、流式细胞仪、透射电镜 、酶标分析仪等。 DNA Marke。 MTT法测定药物对H22细胞的半数致死量浓度 试验设6个组，其中2个对照组，阳性对照5Fu组及正常对照组；另设4个药物浓度组，FGC组10L，温育4h，2000r/
3、min离心10min，弃去上清液，加入二甲基亚砜150L，振荡混匀。酶标分析仪492nm波长处测A值,各孔的A值为测试孔的A值减去空白孔A值，按下式计算细胞生长抑制率。根据各药物组抑制百分率和药物浓度的相关性得出直线回归方程，然后求出半数致死量浓度。 细胞生长抑制率=NS组A值加中药组A值NS组A值 100% 药物对体外培养的H22细胞的促凋亡作用 试验设4个组，其中2个FGC6药物浓度组，分别为FGC组、FGC组；2个对照组，分别为阳性对照5Fu组及正常对照组。调整小鼠肝癌H22细胞浓度为1105个/mL，取于培养瓶中培养，37、5%CO2 饱和水汽二氧化碳细胞培养箱中培育24h后，阳性对照
4、组加入 5Fu,NS组加入培养液，FGC组、FGC组分别加入不同浓度的药物。共同培养48h后，收获细胞,进行下一步检测。 2009年6月张永英等：中药复肝春6号体外诱导小鼠肝癌H22细胞凋亡实验研究第3期2009年6月河北北方学院学报第3期 肿瘤细胞DNA ladder分析 收集药物作用48h的肿瘤细胞，每组约2107个，提取凋亡细胞的DNA，进行DNA ladder分析。取NS组DNA溶液、DNA marker和各药物作用下的凋亡细胞DNA溶液各5L，于含溴化乙锭%的琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳缓冲液为TBE，电压为5V/cm，待样品迁移至凝胶长度的3/4时停止电泳，于凝胶分析系统处观察DNA
5、条带并照相。 流式细胞仪技术检测肿瘤细胞周期时相和凋亡率 收集药物作用48h的肿瘤细胞，每组约1107个，用PBS清洗两次，用75%的乙醇固定过夜，调整细胞浓度，做成单细胞悬液，避光染色30min,上流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率，并用Multicycle DNA Acontent and cell cycle Analysis软件处理结果。 透射电镜技术检测凋亡细胞超微结构 4离心收集5106个细胞，用PBS清洗2次。在2min之内加入%的戊二醛，固定过夜，再用10mg/mL锇酸固定,逐级乙醇脱水，氧化丙烯浸透，树脂包埋，超薄切片机切片，于透射电子显微镜下观察凋亡细胞的形态学变化并摄影。 数
6、据统计处理 表中数据均以xs表示，所有数据均利用SAS统计分析软件GLM模型进行分析，各组均数的比较采用SNKq检验。 2 结果 FGC6对肝癌H22细胞的半数致死量浓度的确定 不同浓度组药物作用于H22细胞24h后，用MTT法测定其OD492值，经计算半数致死量为 mg/mL,结果见表1。 肿瘤细胞DNA 琼脂糖凝胶电泳结果 肿瘤细胞DNA 琼脂糖凝胶电泳结果显示：FGC组、FGC组及5Fu组可见明显的梯状DNA条带，其条带大小约为180200bp的整数倍，这说明细胞凋亡现象明显。NS组肿瘤细胞DNA完整清晰，无明显降解，无梯状DNA条带,结果见图1。表1 FGC6对肝癌H22细胞增殖抑制作
7、用 (xs)注：与NS组相比较，与Fu组相比较*注：与NS组相比较;与5Fu组相比较 流式细胞仪技术检测细胞凋亡率和细胞周期分布 收集细胞，用75%冷乙醇固定过夜，上机前去除乙醇，PBS调整H22细胞浓度为1106/mL，Rnase消化20min。作成单细胞悬液，荧光染色，37孵育30min，上流式细胞仪进行细胞周期和凋亡分析。流式细胞仪检测是通过小分子DNA片段丢失检测亚二倍体峰来识别凋亡细胞。细胞凋亡时因为有DNA的断裂丢失，细胞DNA含量就较二倍体少。检测结果显示FGC6药物作用下的小鼠H22肝癌细胞细胞周期时相发生变化，与NS组和5Fu组相比G1期细胞百分比数量明显增加，差异有统计学意
8、义；G2期细胞百分比数量也有明显变化，差异有统计学意义；S期细胞百分比明显减少，差异有统计学意义。说明FGC6作用于肝癌H22细胞主要调控点在G1/G0期。而5Fu组和NS组相比较3个周期时相没有明显差异，结果见图2和表2。 图2 DNA含量分布图凋亡率检测结果显示：随药物浓度的增加细胞凋亡率明显上升。从结果看，药物组细胞凋亡率明显高于NS组，差异有统计学意义。与5Fu组相比FGC组差异有显着性，见图3和表3。注：与NS组相比较;与5Fu组相比较 电镜技术检测凋亡细胞的超微结构变化 电镜技术检测FGC6作用48h的小鼠H22肝癌细胞凋亡图片显示，正常肿瘤细胞处于增殖末期，染色单体平均分配到细胞
9、两极，核膜小泡重新包围两组染色体，相互融合形成完整的核膜，并在两极重新形成新的细胞核，胞质密度均匀，细胞器分布于细胞内，染色质松散分布于细胞核内。5Fu组肿瘤细胞可见核膜呈锐角突起，核染色质密度增高，凝聚在核膜周边，内质网扩张呈泡状，胞浆浓缩，核染色质边集于核膜下，厚薄不均匀，细胞膜内陷，细胞器明显减少。FGC组电镜下细胞内容物减少，细胞溶涨，细胞死亡特征明显。FGC组肿瘤细胞可见局部核膜向外呈圆球状突出，胞浆浓缩，内质网扩张呈泡状，核染色质密度增高，轻度边集于核膜下且厚薄不均。 3 讨论FGC6诱导肿瘤细胞凋亡的作用 凋亡细胞最重要的生物化学反应是内源性核酸内切酶基因的活化和表达，使细胞核内
10、的染色质DNA在核小体单位之间的连接处被Ca2+、Mg2+依赖性核酸内切酶降解，产生若干大小不一的寡核苷酸片段，这些片段由180200个碱基对整数倍的寡核苷酸组成，即核小体重复单位的大小。在琼脂糖凝胶上电泳呈现梯状DNA区带图谱1，是凋亡的典型生化特征。本实验发现FGC组、FGC组、5Fu组肿瘤细胞DNA电泳结果中均出现凋亡梯状DNA条带，而NS组DNA完整清晰，未见降解带出现，说明这三组肿瘤细胞的凋亡率远远高于NS组。透射电镜发现FGC组细胞内容物减少，细胞内有大量空泡存在。究其原因可能是因为药物浓度过大，造成细胞大量坏死。中药诱导肝癌细胞凋亡，并不是剂量越大、时间越长越好，当药物浓度较大,
11、作用时间延长细胞数量明显减少，而且有大量碎片，最终导致细胞膜破裂，细胞核裂解，说明有部分细胞发生了死亡而不是凋亡。和FGC组相比5Fu作用后，肿瘤细胞出现典型的核膜锐角突起，核染色质密度增高，凝聚在核膜周边，内质网扩张呈泡状，胞浆浓缩等典型的凋亡特征，结合生长曲线可以说明中药FGC6号诱导细胞凋亡发生速度较慢，而5Fu作用后，发生凋亡速度较快，这和文献报道相一致。这是因为药物诱导细胞凋亡的作用特点不同，可能与其对核酸DNA的作用方式不同有关，如环磷酰胺等化疗药物为生物烷化剂，具有高度的化学活性，能直接作用于细胞的核酸和酶等部位，一般以共价键结合，使细胞结构和理化性质发生变异，抑制细胞分裂，导致
12、细胞死亡。中药复方成分复杂，一般通过细胞毒作用，即损伤DNA而发挥作用。 通过细胞周期阻滞来诱导细胞凋亡成为抗肿瘤药物研究的一个靶点。许多中药能够作用于细胞周期的某一个环节，而使细胞增殖周期受阻，诱导其发生凋亡。本实验中流式细胞仪技术检测FGC6作用48h的小鼠H22肝癌细胞凋亡率和细胞周期分布显示，FGC6药物作用下的小鼠肝癌H22细胞细胞周期时相发生变化，G1期细胞百分比含量明显增加，与NS组相比差异极显着；G2期细胞百分比含量明显减少，差异极显着；S期细胞百分比明显减少，差异极显着；表明FGC6能明显阻滞肝癌H22细胞由G1期进入S期，使其停滞于G1/G0期。说明FGC6作用于肝癌H22
13、细胞主要调控点在G1/G0期。G1期被阻断,就可以阻断DNA的复制和合成，从而能有效的控制肿瘤细胞的增殖。进而导致其发生凋亡。而5Fu组和NS组相比较3个周期时相均没有明显差异，这和文献报道 5Fu诱导肿瘤细胞凋亡是通过将细胞阻滞于S 期而抑制其增殖不一致。这可能是由于Fu作用于不同细胞株的结果，但具体原因还有待于进一步研究。 以上研究结果说明FGC6可抑制肿瘤细胞的恶性增殖。李秀娟等在复肝春6号对小鼠肝癌的抑制作用及对荷瘤小鼠免疫功能的影响中阐明FGC6诱导肿瘤细胞凋亡作用与其降低bcl2基因的蛋白表达量，同时升高bax基因的蛋白表达量有关。 【参考文献】 1 Roy C,Brown DL,
14、Litter JE,erTopoisomerase inhibitor teniposide (VM26) induces apoptosis in unstimulated mature murine lymphocytesJ.Cell Res,1992,200(2):416424 2 吕冬霞,王晓丽,魏凤香,等.玉米须多糖诱导人肝癌SMMC7721细胞凋亡的研究J.黑龙江医药科学,2006,29 (4):28293 ltvai ZN,Korseyerof duelling dimers foil death wishesJ.Cell,1994,79:1994 李锦毅,谭毅,王玉良.扶正健脾
15、汤对肝癌脾气虚证药效学及细胞周期作用的实验与临床研究J.中国实验方剂学，1999,5(6):36375 梁重峰,潘立群.中医药调控肿瘤细胞凋亡的研究进展J.甘肃中医,2005,18(3):47486 赵晓琴.复方龙葵糖浆诱导小鼠H22肝癌细胞凋亡作用机制研究J.辽宁中医杂志,2005,32(9):9749757 ZhuTheory of TumorM.Shanghai:Shanghai Scientificand Technical Publisher,19868 Wiebke EA,Grieshop NA,Loehrer PJ,eteffects of 5 fluorouracil on human colon cancer cell lines:antagonism by levamisoleJ.J Surg Res,2003,111(1):63699 李秀娟,毛宇湘,张焕铃,等.复肝春6号对小鼠肝癌的抑制作用及对荷瘤小鼠免疫功能的影响J.中国中药杂志，2006,31(19):16221625
