生物工程下游技术

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1、生物工程下游技术生物工程下游技术的定义 指从动植物与微生物的有机体或器官、生物工程产物（发酵液、培养液）及其生物化学产品中提取、分离、纯化有用物质的技术过程。 实质：是研究如何从混合物中把一种或几种物质分离出来的科学技术。 1.生化工程分离技术预处理结晶干燥离心法：离心过滤、离心沉降、超离心萃取法：有机溶剂、双水相、液膜、反胶团、超临界层析法：凝胶过滤层析、反相层析、亲和、疏水相互作用、聚焦、离子交换膜分离：微滤、超滤、反渗透、透析、电渗透2.生物物质常用的分离技术氨基酸 ：结晶和离子交换法 蛋白质和多肽 ：离子交换层析、电泳 糖类 ：吸附层析 脂质：有机溶剂萃取、超临界流体萃取和层析 抗生素

2、 ：有机溶剂萃取、离子交换、结晶和吸附层析3. 生物分离方法的选择与评价原则：步聚少，次序合理，产品规格 （注射，非注射），生产规模 ，物料组成，产品形式，产品稳定性，危害性，物性： 溶解度、电荷、分子大小、功能团、稳定性、挥发性，废水处理4.浓缩率：浓缩程度一般用浓缩率(concentration factor)表达，是一个以浓缩为目的的分离过程的最重要指标。浓缩率为m，mt=mx则目标产物未得到任何程度的分离纯化。5.分离因子：分离因子又称分离系数。产品中目标产物浓度越高，杂质浓度越低，则分离因子越大，分离效率越高。6. 回收率：无论是以浓缩还是以分离为目的操作过程，目标产物均应以较大的比

3、例回收, 回收率R：生物分离操作多为间歇过程（分批操作），若原料液和产品溶液的体积分别为VC和VP。1 生物产品与普通化工产品分离过程有何不同？2 设计生物产品的分离工艺应考虑哪些因素？3 分离纯化的回收率与浓缩率如何计算？4 现代生物分离工程研究方向有哪些特点？5 分离纯化指标有哪些?简述pH对发酵液过滤特性的影响，并举例说明。答：（1） pH直接影响发酵液中某些物质的电离程度和电荷性质，因此适当调节pH值可以改善发酵液的过滤特性。（2）氨基酸和蛋白质在酸性条件下带正电，碱性条件下带负电，等电点时净电荷为零，两性物质在等电点下的溶解度最小，等电点沉淀法在生物工业分离中广泛使用。（3）如味精生

4、产，利用等电点沉淀法提取谷氨酸，一般蛋白质也在酸性范围达到等电点；膜分离中可通过调整pH值改变易吸附分子的电荷性质，减少膜堵塞和膜污染；此外，细胞、细胞碎片及某些胶体物质等在特定pH下也可能趋于絮凝而成为较大颗粒，有利于过滤进行。第二章1.预处理的目的：促进从悬浮液中分离固形物的速度，提高固液分离的效率：改变发酵液的物理性质，包括增大悬浮液中固体粒子的尺寸，降低液体黏度。相对纯化，去除发酵液中的部分杂质（高价无机离子和杂蛋白质），以利于后续各步操作。尽可能使产物转入便于后处理的一相中（多数是液相）；2.预处理的方法凝聚和絮凝 加热法调节悬浮液的pH值 杂蛋白的去处高价无机离子的去处 助滤剂反应

5、剂 3凝聚与絮凝：.凝聚与絮凝处理过程就是将化学药剂预先投加到悬浮液中，改变细胞、菌体和蛋白质等胶体粒子的分散状态，破坏其稳定性，使其聚集起来,增大体积以便固液分离。凝聚和絮凝技术常用于菌体细小而且黏度大的发酵液的预处理中。凝聚和絮凝是两种方法，两个概念。凝聚：指在投加的化学物质（铝、铁的盐类）作用下，胶体脱稳并使粒子相互聚集成 mm 大小块状凝聚体的过程。机理： 1）中和粒子表面电荷 2）消除双电层结构 3）破坏水化膜胶体双电层结构发酵液中菌体表面带有负电荷，由于静电引力使溶液中反离子被吸附在其周围，在界面上形成了双电层。正离子同时受到使它们均匀分布的热运动影响，具有离开胶粒表面的趋势。两种

6、相反作用力下，双电层分裂成两部：1）吸附层或stern层；2）扩散层。扩散双电层的结构模型(Gouy-Chapman-Stern model)。两种相反作用力下，双电层分裂成两部：1）吸附层或stern层；2）扩散层。扩散双电层的结构模型(Gouy-Chapman-Stern model)。絮凝：指使用絮凝剂（天然的和合成的大分子量聚电解质）将胶体粒子交联成网，形成10mm大小絮凝团的过程。其中絮凝剂主要起架桥作用。机理：架桥作用采用絮凝法可形成粗大的絮凝体，使发酵液较易分离。人工合成有机高分子聚合物、天然有机高分子聚合物、无机高分子聚合物聚丙烯酰胺类絮凝剂的优点用量少，一般以mg/L计量；絮

7、凝体粗大，分离效果好；絮凝速度快；种类多，适用范围广。聚丙烯酰胺类絮凝剂的缺点：存在一定的毒性，特别是阳离子型聚丙烯酰胺，用于食品和医药工业时应谨慎。天然有机高分子絮凝剂具有无毒，易生物降解，原料来源广等优点。天然有机高分子改性絮凝剂根据其原料来源不同可分为淀粉类、纤维素类、植物胶类和聚多糖类。其中淀粉改性絮凝剂的研究开发最引人注目。微生物絮凝剂是近年来研究和开发的新型絮凝剂，由微生物或其分泌物产生的具有絮凝细胞功能的代谢产物。主要成分是糖蛋白、粘多糖、纤维素及核酸等高分子物质。微生物絮凝剂和天然絮凝剂最大的优点是安全，无毒和不污染环境。4.助滤剂：一种不可压缩的多孔微粒，菌体可吸附于助滤剂微

8、粒上，降低了滤饼的可压缩性，减小了过滤阻力。常用的助滤剂是硅藻土，其次是珍珠岩粉、活性炭、石英砂、石棉粉、纤维素等。(1)粒度根据悬浮液中的颗粒和滤液的澄清度确定，一般颗粒较小的滤饼应采用细小的助滤剂。(2)助滤剂的品种根据过滤介质选择助滤剂品种。使用粗目滤网时易泄漏，可选择石棉粉、纤维素；采用细目滤布时，可使用细硅藻土；(3)用量间歇操作时，过滤介质表面预涂助滤剂，其厚度应不小于2mm。连续过滤机中根据过滤速度确定。使用硅藻土时，通常细粒为500g/m3，中等粒度700g/m3,粗粒700-1000g/m3。5.反应剂：加入某些不影响目标产物的反应剂，可消除发酵液中的一些杂质对过滤的影响，从

9、而提高过滤速度。 1）反应剂与某些可溶性盐类发生反应生成不溶性沉淀,生成的沉淀能防止菌丝体粘结，使菌丝具有块状结构，又能使蛋白质凝固，过滤性能上升，沉淀本身可作为助滤剂. 如新生霉素发酵液中加入CaCl2和Na3PO4，生成Ca3(PO4)2沉淀。2）发酵液中含有不溶性多糖物质时，用酶将其转化为单糖，以提高过滤速率。 如万古霉素用淀粉作培养基，发酵液过滤前加入0.025%的淀粉酶，搅拌30min后，再加2.5%硅藻土助滤剂，可提高过滤效率5倍。6. 杂蛋白的去除方法沉淀法 A 等电点沉淀法 （isoelectric precipitation ）蛋白质的等电点大都在酸性范围内(pH4.05.5

10、)，调节发酵液的pH到蛋白质的等电点是除去蛋白质的有效方法。B. 酸碱调节，使蛋白质与离子形成沉淀在酸性溶液中，蛋白质与一些阴离子形成沉淀，如三氯乙酸盐、水杨酸盐、苦味酸盐等；在碱性溶液中，蛋白质与一些阳离子形成沉淀，如Ag+、Cu2+、Zn2+、Fe3+等。变性蛋白质从有规则的排列变成不规则结构的过程称为变性。变性蛋白质溶解度较小。加热，大幅度调节pH值，加酒精、丙酮等有机溶剂或表面活性剂等。不足之处：加热法只适合于对热较稳定的目的产物；极端pH值也会导致某些目的产物失活，且要消耗大量酸碱；有机溶剂法通常只适用于所处理的液体数量较少的场合。 1.沉淀法主要包括 盐析法，有机溶剂沉淀法，等电点

11、沉淀法，结晶法等 等。2.按照一般的习惯，析出物为晶体时称为 结晶 ，析出物为无定形固体则称为 沉淀 。3.影响盐析的因素有：无机盐的种类、溶质（蛋白质等）种类的影响、蛋白质浓度的影响、温度的影响、pH的影响。吸附法加入某些吸附剂或沉淀剂吸附杂蛋白质而除去。四环类抗生素生产中，采用黄血盐和硫酸锌的协同作用生成亚铁氰化锌钾K2Zn3Fe(CN)52的胶状沉淀来吸附蛋白质，利用此法除蛋白质已取得很好的效果。在枯草杆菌发酵液中，常加入氯化钙和磷酸氢二钠，这两者本身生成庞大的凝胶，把蛋白质、菌体及其它不溶性粒子吸附并包裹在其中而除去，从而加快了过滤速度。1 发酵液为何需要预处理？处理方法有哪些？其简要

12、机理如何？2 凝集与絮凝过程有何区别？如何将两者结合使用？3 除去发酵液中杂蛋白常用方法有哪些？4 简述胶体双电层结构及稳定性机理?5 什么是助滤剂和反应剂？能列举1-3个应用的例子1. 盐析法：是利用各种生物分子在浓盐溶液中溶解度的差异，通过向溶液中引入一定数量的中性盐，使目的物或杂蛋白以沉淀析出，达到纯化目的的方法。2. Ks盐析：在一定的pH和温度下改变离子强度（盐浓度）进行盐析，称作Ks盐析法。Ks盐析法多用于提取液的前期分离工作。3盐析：在一定离子强度下仅改变pH和温度进行盐析，称作盐析法。在分离的后期阶段，为了求得较好的分辨率，或者为了达到结晶的目的，有时应用盐析法。盐析法由于溶质

13、溶解度变化缓慢且变化幅度小，沉淀分辨率比KS盐析法好。4亲和沉淀:利用亲和反应原理，将配基与可溶性的载体偶联后形成载体-配基复合物（亲和沉淀剂），该复合物可选择性地与蛋白质结合，在一定条件下沉淀出来。四 问答1.什么是盐析作用？盐析的原理是什么？答：盐析作用：向蛋白质溶液中逐渐加入中性盐，在高盐浓度时，蛋白质溶解度随之减小，发生了盐析作用。产生盐析作用的一个原因是由于盐离子与蛋白质表面具相反电性的离子基团结合，形成离子对，因此盐离子部分中和了蛋白质的电性，使蛋白质分子之间电排斥作用减弱而能相互靠拢，聚集起来。盐析作用的另一个原因是由于中性盐的亲水性比蛋白质大，盐离子在水中发生水化而使蛋白质脱去

14、了水化膜，暴露出疏水区域，由于疏水区域的相互作用，使其沉淀。2.如何选择盐析所用中性盐？（1）盐析作用要强。一般来说多价阴离子的盐析作用强，有时多价阳离子反而使盐析作用降低。（2）盐析用盐要有足够大的溶解度，且溶解度受温度影响应尽可能小。这样便于获得高浓度盐溶液，有利于操作，尤其是在较低温度下的操作，不致造成盐结晶析出，影响盐析效果。（3）盐析用盐在生物学上是惰性的，不致影响蛋白质等生物分子的活性，最好不引入给分离或测定带来麻烦的杂质。（4）来源丰富、经济。3.有机溶剂沉淀的原理是什么？答：亲水性有机溶剂加入溶液后降低了介质的介电常数，使溶质分子之间的静电引力增加，聚集形成沉淀；水溶性有机溶剂

15、本身的水合作用降低了自由水的浓度，压缩了亲水溶质分子表面原有水化层的厚度，降低了它的亲水性，导致脱水凝集。4.有机溶剂沉淀影响沉淀效果的因素有那些？答： （1）有机溶剂种类及用量（2）pH的影响（3）温度无机盐的含量（4）某些金属离子的助沉淀作用(5)样品浓度第三章1. 影响发酵液固液分离的因素1）发酵液中悬浮离子的大小2）发酵液的黏度viscosity ：固液分离速度通常与粘度成反比，粘度越大，固液分离越困难。影响粘度的因素：菌体的种类和浓度(重要因素)培养液中蛋白质、核酸大量存在培养基成分此外，某些染菌发酵液，如染细菌，则粘度会增大。发酵过程的不正常处理，如大量过剩的培养基和消沫油加入，都

16、会使粘度增大。2.常见的固液分离方法过滤 filtration过滤操作是借助于过滤介质，在一定的压力差P作用下，使悬浮液中的液体通过介质的孔道，而固体颗粒被截留在介质上，从而实现固液分离的单元操作。离心 Centrifugation 离心分离是基于固体颗粒和周围液体密度存在差异，在离心场中使不同密度的固体颗粒加速沉降的分离过程。扩张床吸附 EBA(Expanded Bed Adsorption)一种新型的生物分离技术：集成化分离技术，即对已有的两种或两种以上的单元操作进行有效的组合，组成一种有效的单元操作，以达到提高产品收率、缩短纯化步骤、降低纯化费用和投资成本的目的2.固液分离过滤设备按操作方式分类：间歇过滤机、连续过滤机按操