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1、东华大学研究生复试资料（分子和生物化工）1、一个标准的分子生物学实验室应该具备哪些硬件和软件？ 答：一个标准的分子生物学实验室应包含以下部分： 实验室（24-25）、仪器分析室（精密光学）、离心机室、细胞培养室、放射性核素操作室、冷室（4-8）、暗室（自显影、32P、蛋白）、消毒室、洗涤室、水处理室、恒温室（16，37）、动物饲养室等。 2、离心机都有哪些？划分依据？ 答、普通离心机： 最大转速为6000r/min、最大离心力为6000g 高速离心机： 最大转速为25000r/min、最大离心力为89000g 超速离心机： 最大转速为90000r/min、最大离心力为694000g 离心机分类
2、依据： 高速离心机是指转速高达20000到25000r/min，主要用于生物大分子的微量操作。超速离心机以其能超过500000g（75000r/min，r=8cm）的离心力。 普通离心机转速在6000r/min，最大离心力6000g。 3、实验室常规的仪器设备？ 答：温度控制系统：应该具备不同温控级别的冰箱，其中最常使用的有：4， -20，-80冰箱； 37温箱；烤箱；100水浴摇床；水的净化装置；消毒设备；计量系统：常用的电子天平等，可调式微量移液器等、PH计、紫外可见分光光度计；其他设备：微波炉，真空加热干燥箱，电泳凝胶干燥器，凝胶呈像系统等。 4、核酸纯化的试剂有哪些？都有什么作用，原理
3、是是么？如何辨别酚是否能使用？不能使用的原因是什么？加入八羟基喹啉的作用是什么？-巯基乙醇的作用又是什么？水饱和酚和TE饱和酚分别用在提取什么核酸上？酚怎么保存？ 答： 核酸纯化过程中涉及到的主要试剂：酚，氯仿，异无醇。 酚：可有效地变性蛋白质，但是不能完全抑制RNA酶活性，而且酚能溶解10-15%的水，从而能溶解一部分poly(A)RNA。 氯仿：变性蛋白质，能加速有机相与液相分层，去除植物色素和蔗糖。 异无醇：异戊醇可以降低表面张力，减少在去除蛋白质过程中产生的泡末，另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定，最后用氯仿处理，是去除核酸溶
4、液中的迹量酚。用乙醚处理，可去除迹量氯仿。 酚如果无色透明可以使用，变色（结晶曾现粉红色或黄色）则不可以使用。因为：酚已经被氧化而成醌、二酸，酚氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键，并引起DNA链的交联。 加入八羟基喹啉的作用：减少酚的氧化；提供颜色指示(黄色), 使酚抽提时分层界面易于鉴别, 同时也指示酚的储存时间与质量；抑制RNA酶的活力；螯合金属离子并抑制DNA酶作用。 -巯基乙醇：是还原剂减少酚被氧化。 水饱和酚用在提RNA； TE饱和酚用在DNA。 蒸馏酚要装入棕色试剂瓶中，4保存一个月。 乙醇的作用：核酸盐可被一些有机溶剂沉淀,通过沉淀可浓缩核酸, 加乙醇的目 的就是沉淀核酸。 5、沉淀核
5、酸加什么阳离子？提取那一种核酸加什么离子？作用原理是什么？ 答：核酸是多聚阴阳离子的水溶性化合物，它与纳、钾、镁、形成的盐在许多种有机溶剂中不溶解，但也不会被有机溶剂变性，形成两相。 氯化纳用于沉淀提取液里含有SDS的DNA样； 醋酸铵：反转录酶、DNA聚合酶、Tag酶、以及末端转移酶和磷酸化酶等催化的生化反应，为去除未掺入的dNTP和NTP，普遍使用铵离子沉淀核酸，但是铵盐是T4噬菌体多核苷酸激酶的抑制剂！在DNA需要进行磷酸化和末端补平反应时，不能采用铵盐沉淀； 氯化锂：在0.8mol/L LiCl的强离子浓度条件下，可溶解tRNA与5S RNA， 而大分子量的mRNA、rRNA则不溶解，
6、可通过离心进行分离，常用于mRNA提取。 氯化镁：Mg2+是核酸沉淀中的有效离子, 当核酸浓度低于0.1ug/ml 或长度小于100个核苷酸时，加入10mM/L M 2+可明显提高核酸沉淀的回收率。 醋酸钾:沉淀效果和醋酸钠相同，但是核酸的钾盐形式很难溶于含有SDS的溶液，所以，如果在提取核酸的缓冲液中有SDS时，不易采用。 6、沉淀核酸常见的温度，时间，离心转速和时间通常在什么范围之内？ 答：一般条件下的DNA沉淀，使用0 冰水，1015分钟可达到实验的要求。 大多数的DNA沉淀可在04，12000g离心10分钟即可，对于浓度低于20ng/ml的DNA沉淀，上述离心条件也可以完成。如DNA片
7、段小于100个核苷酸时，则需要超速离心；27000r/min，1-2小时，4 条件下进行。如果对于pg水平的核苷酸，则应该加入tRNA作为载体进行共沉淀。 7、为什么要用乙醇沉淀核酸？ 答：沉淀DNA时，乙醇是首选的有机溶剂，它对盐类沉淀少，DNA沉淀中所含的迹量乙醇易蒸发去除。在适当的盐离子浓度下，2倍体积的95%乙醇可有效沉淀DNA，对于RNA，则需要将乙醇的量增加2.5倍 8、核酸的定量，定量的原理是什么？纯度，完整性有哪些手段评价？核酸如何保存？ 答：组成核酸分子的碱基，均具有一定的吸收紫外线特性，最大吸收值在波 长250270nm之间,利用这一特性可以用紫外分光光度法定量测定核酸。在
8、波长260nm紫外线下，1 OD值的光密度相当于双链DNA浓度为50ug/ml；单链DNA或RNA为40ug/ml；单链寡核苷酸为20ug/ml。可以此来计算核酸样品的浓度。 分光光度法即可测定核酸的浓度，也可确定核酸的质量。A260/280的比值：DNA为1.8， 如果比值高于1.8，说明DNA制剂中有RNA存在；如果比值低于1.8，说明污染有蛋白质或提取过程中残留的酚等，RNA样品OD 260/280的比值小于2 完整性可以用琼脂糖凝胶电泳检测，在有标准Marker存在下，通过电泳跑出的条带多少、大小可以比对提取的核酸是否完整。 DNA：最好是溶于TE中于4保存，其中EDTA是通过整合金属
9、2价离子，来抑制DNA酶的活性。TE的pH为8，是为了减少DNA的脱氨反应，放在-70 能保存5年以上。 RNA：溶于0.3mol/L醋酸钠（pH5.2)或双蒸消毒水中，储放于-70 。长期保存可以以沉淀的形式储存于乙醇中，在-20的情况下，非常安全。 9、何为限制性内切酶？分类？各个类型的特点？常用的主要二是型限制性内切酶有哪些特点？ 答：核酸限制性内切酶：是一类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解 酶。这些酶都是从原核生物中发现的。 分为I、II、III I型酶：属于复合功能酶，兼有修饰和切割DNA两种特性，需要Mg 2+、ATP和S-腺苷酰甲硫氨酸作为辅助因子，在DNA降解时伴随有A
10、TP的水解。即它具有核酸内切酶、甲基化酶、ATP酶、和DNA解旋酶四种活性。若酶的识别位点上两条DNA链均未甲基化，就能行使内切酶功能，切割DNA；如果一条DNA链上被甲基化，这个酶就发挥修饰功能，使另一条DNA链甲基化。显著特点：在DNA链上的识别位点和切割位点不一致！ III型酶：与I型限制性内切酶的特性类似，也有甲基化功能，但是无ATP和DNA解旋酶活力。不同的是它能在DNA链上的特异位点切割，其切割位点在识别位点以外。所以，应用价值不大。 II型酶：通常指的是DNA限制性内切酶， ? II型酶分别由限制酶和修饰酶两种不同的酶组成。 ? II型限制酶分子量小，需要Mg2+作为催化反应辅助
11、因子，它们能识别双链 DNA的特异序列，并在这个顺序内进行切割，产生特异的DNA片段。 ? 识别序列一般为46个碱基对，识别的顺序为反转重复序列，且富含GC。 ? II型DNA限制性内切酶的靶序列大小决定了它切割DNA后产生DNA片段 的长短。若DNA链上的碱基随机分布，在一条很长的DNA链上，对于识别4个核苷酸的内切酶，平均44个核苷酸长度就出现一个靶序列； ? II型DNA限制性内切酶切割双链DNA后产生三种不同的切口：1）在识别 顺序的对称轴上，对双链同时切割形成平末端；2）在识别顺序的双侧末端切割DNA双链，于对称轴的5末端切割产生5端突出的粘性末端（EcoR I)；3）反之，产生3端
12、突出的粘性末端（如PstI）。 ? II型DNA限制性内切酶不具有甲基化修饰活性，这一功能由相应的修饰酶 承担。它们识别同一DNA特定序列，发挥不同的作用。 ? 一些特殊性质的少数II限制性内切酶： 1、异源同工酶，也称同裂酶：是不同来源分离出来的不同酶，但是具有相同的识别序列，切割DNA的方式可以相同，也可不同。 2、Subset酶：识别与切割顺序相互有关的酶，如：Smal的6个核苷酸序列中包含有HpaII的四个核苷酸序列 3、远距离裂解酶：这类酶的识别位点与切割位点不一致，它们在某一核苷酸区域与识别序列相结合，然后滑行到识别序列以外的另一个位点进行切割，这一特性与I型酶类相似，但是，它的切
13、割位点与识别位点是一定的，而且没有I型酶那么远，一般为10个碱基左右。 4、可变酶：这类酶是II型酶中的一个特例，它们的识别序列中的1个或几个核苷酸是可变的，并且其识别序列一般大于6个碱基。 II酶酶通常指的是DNA限制性内切酶，II型酶分别由限制酶和修饰酶两种不同的酶组成。 II型限制酶分子量小，需要Mg2+作为催化反应辅助因子，它们能识别双链DNA的特异序列，并在这个顺序内进行切割，产生特异的DNA片段。II型限制酶的识别序列一般为46个碱基对，识别的顺序为反转重复序列，即具 有180的旋转对称性，且富含GC。 10、二型限制性内切酶酶切之后会产生什么样的末端？并图示出来？3突起，5突起，
14、平端？ 答：II型DNA限制性内切酶切割双链DNA后产生三种不同的切口：1）在识别顺序的对称轴上，对双链同时切割形成平末端；2）在识别顺序的双侧末端切割DNA双链，于对称轴的5末端切割产生5端突出的粘性末端（EcoR I)；3）反之，产生3端突出的粘性末端（如PstI）。 平端Alu I: AGTGCGTAGCTCGCGTAGT TCACGCATC GAGCGCATCA 5端突起的黏性末端 EcoR I: 5-AGTGCG AATTCGCGTAG-3 3-TCACGCTTAA GCGCATC-5 3端突出的粘性末端 Pst I酶切: 5-TAAGTGCTGCA GGCGT-3 3-ATTCAC
15、G ACGTCCGCA-5 11、限制性酶切缓冲体系化学成分，其作用？加牛血清白蛋白的作用？反应温度通常是多少？酶切时间与酶量身什么关系？怎样计算？酶多加或者少加有什么关系？为什么要定在50微升？200微升行不行？加EDTA为什么能终止反应？部分酶切？ 答：反应缓冲液的成分主要是：Tris.Cl、NaCl和Mg 2+，内切酶都需要Mg 2+ 作为辅助因子，Buffer 的pH一般为7.2-7.6之间。 有的限制性内切酶的反应需要BSA，加小牛血清的作用是稳定酶的构象 绝大多数限制性内切酶的反应温度为37。 酶解时间可通过加大酶量而缩短。酶量少，可通过延长酶解时间以达到完全酶解DNA的目的。同时与加入的DNA量也有关。 酶的量根据酶催化活性和DNA的量来计算：酶的活性单位是1小时内在50ul容积中，酶解1ug DNA所需要的酶量，那么先测定所要酶切的DNA样的量X微克，那么酶溶液的量为：X乘以酶活性单位就等于所加酶体积。加入的酶量或容积不能超过反应总体积的10%。 可以通过加入EDTA来终止酶切，因为EDTA为镁离子的螯合剂，从而使酶失去活性终止酶切。 部分酶切就是利用上一原理，通过在一定时间内加入EDTA来中断酶切实
