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1、畜禽粪便消化液的部分短程硝化和厌氧氨氧化及其微生物群的分析摘要：运用混凝剂处理的部分短程硝化摇床和厌氧氨氧化UASB反应器来处理畜禽粪便消化液。部分短程硝化在1.6kgN/m3/d的氮负荷（NLR），平均转化效率是51%的条件下保持了32天，在2.58N/m3/d的NLR下得到了1.65N/m3/d的最大亚硝酸盐生成率。尽管部分短程硝化反应器的出水中仍有200mg/L的TOC，厌氧氨氧化脱氮率没有明显减小，并且在2.2N/m3/dNLR下得到了一个相对较高的2.0N/m3/d的NLR。16S rRNA 基因分析显示，亚硝化单胞菌和KSU-1在部分短程硝化和厌氧氨氧化反应器里分别占大多数。实验结
2、果证明了部分短程硝化-厌氧氨氧化工艺可能应用于畜禽粪便消化液的脱氮。关键字：部分短程硝化、厌氧氨氧化、畜禽粪便、消化液、微生物群落1 引言从能量回收的观点看，畜禽粪便的厌氧甲烷发酵近期已经引起了人们的注意。但是甲烷厌氧发酵不能有效去除氮和磷，因此消化液既可以作为液体废料回收也可以进一步做深度处理。厌氧消化液深度处理的利用，需要投资和高昂的操作费用，这就决定了在日本，消化液会被主要用做肥料。然而，由于消化液中尚存高浓度的氮，其过度用作肥料会导致地下水污染。因此，找到一种可供选择的方式来有效处理消化液，从而用一种对环境安全的方式利用畜禽粪便甲烷发酵是极为重要的。硝化-反硝化是通常用于消化液脱氮的方
3、式。当应用这个工艺时，需要大量的氧气、适合硝化的碱度和外加碳源，比如反硝化需要的甲醇。通过比较得出，自2002年发展起来的部分短程硝化-厌氧氨氧化工艺是一种有成本效益的工艺。厌氧氨氧化反应由以下过程组成：在厌氧环境下，以亚硝酸盐作为电子受体，氨气被氧化为氮气的过程。这个自养过程产生极少的污泥，也不需要补充碳源。因为预处理只需要氨转化为氮的转化率在60%左右的部分短程硝化（PN），而不需要完全硝化，所以硝化所需的氧和碱度都可以减少。部分短程硝化-厌氧氨氧化工艺最适合用于治理含高浓度铵盐的废水，还可以用于治理污水污泥消化液，畜禽废水、垃圾渗滤液体和电厂废水。近来，逐步有这种技术被应用到畜禽废水的报
4、道。实验采用摇床反应器进行PN，使用过滤系统做前处理，用固定床反应器进行厌氧氨氧化反应，以此来处理养猪废水消化液。我们的报告指出，PN在长时间内保持稳定，但用有机混凝剂处理PN出水时，厌氧氨氧化脱氮效率却显著降低。Furukawa et al. (2009)证明利用被截留在聚乙二醇（PEG）凝胶载体上的硝化活性污泥的PN反应器和利用被截留在PEG凝胶载体上的厌氧氨氧化污泥的厌氧氨氧化反应器可以被用来处理畜禽粪便消化液。Qiao et al. (2010a)也证明了利用被截留在PEG凝胶载体上的硝化活性污泥的PN反应器和持续搅拌细粒度的厌氧氨氧化反应器可以被用来处理畜禽粪便消化液。但是，Furu
5、kawa et al. (2009)和Qiao et al. (2010a)都没有在PN之前去除悬浮固体。他们的报告指出，流入的悬浮固体经常引起空气扩散器的堵塞，导致PN处理效率的退化。在以前的研究中，已经对PN和厌氧氨氧化过程中微生物群进行了分析。许多研究者称，在短程硝化反应器中检测到了属于亚硝化单胞菌属的细菌。Qiao et al.(2010b)和 Ganigue et al. (2009)也发文说在治理NH4N浓度分别为500mg/L和2700mg/L的污水的PN反应器中，亚硝化单胞菌占大多数。此外，对治理合成无机废水的厌氧氨氧化反应器中的微生物群的分析表明，绿弯菌门细菌和厌氧氨氧化细菌
6、是共生的。然而，直到现在，还没有对PN和厌氧氨氧化反应器治理畜禽废水的微生物群分析，哪种微生物占主导地位也还不清楚。本研究的目的在于将摇床反应器应用到用有机混凝剂处理的PN中，将UASB反应器应用到厌氧氨氧化反应中，以此来治理畜禽粪便消化液，并通过16rRNA基因分析来检测PN和厌氧氨氧化中的细菌群落。2.实验方法2.1畜禽粪便消化液废水取自日本熊本山鹿市的一个沼气厂的消化液储罐。在这个沼气厂里，包括畜禽粪便（62.8t/d）、生垃圾（3t/d）和活性污泥（2t/d）的混合垃圾被分成固体和液体两部分，然后液体垃圾用甲烷发酵（发酵温度为37）处理。废水的各项参数如下：pH为8.5，SS为2000
7、-3000mg/L，COD为8000-10,000mg/L，BOD5为1000-1500mg/L，氨氮为1400-1600mg/L，总氮为1600-2000 mg/L，NO2N和NO3N忽略不计。该畜禽粪便消化液的总氮浓度很高，其中73-88%都是氨氮。因此，在消化液排入天然水体之前，需要对其进行脱氮处理。并且，因为高浓度的氨氮会通过氨的气提造成大气污染，通过渗透也会污染地下水，所以在将消化液用作液体肥料之前，应降低其氨氮浓度。2.2 部分短程硝化的实验装置和操作条件用有机混凝剂（聚丙烯酰胺，美国SNF公司）去除消化液中高浓度的SS。混凝剂的浓度、搅拌速度、搅拌时间和间隔时间分别是：500mg
8、/L、300rpm、5min和10min。废水经混凝处理后平均特性为：pH为8.6，SS为950 mg/L，总COD为6400 mg/L，总氮为1600 mg/L。SS的去除率大约为65%。用于PN处理的摇床反应器在平行的直立装置中有上流部分和下流部分。反应器上流部分和下流部分的横断面积分别是115115mm和11535mm，废水出口的高度为630mm（有效容积10.8L）。泳动床生物填料（丙烯纤维生物载体，日本NET公司）被用作生物载体，其长度取600mm。沉降槽容积为2.5L，水表面积为0.017m2。沉降的污泥被一根链条轻轻地搅拌，100%地回流到摇床反应器中。将22g在完全氧化条件下，
9、用综合污水（主要由蛋白胨和肉膏构成）充-放式培养了很长一段时间的活性污泥接种到反应器中。接种后，给PN反应器投加大约300天的实验污水来驯化污泥。然后就开始连续流动试处理。进水用自来水稀释两倍以调节氮负荷（NLR）直到第12天，之后不再稀释。反应器温度和水力停留时间分别保持在30-32和24-15h。空气流速调节到5L/min直到第76天，之后调节到7L/min。用1mol/L的NaHCO3 和2mol/L的HCl，将反应器的pH值控制在7.6-7.8。2.3厌氧氨氧化的实验装置和操作条件 选用内径为100mm，高度为380mm（有效容积3L）的上流式玻璃柱反应器进行厌氧氨氧化反应（图.1b）
10、。反应器内充满综合无机废水（(NH4)2SO4 5075 mg N/L, NaNO2 5075 mgN/L, KHCO3 250 mg/L, KH2PO4 108 mg/L, T. element 0.5 ml/L(EDTA2Na 10 g/L, FeSO47H2O 18 g/L)）直到脱氮速率（NRR）达到0.5 kg N/m3/d。用综合无机废水驯化厌氧氨氧化污泥之后，进水就变为PN的出水（从第60天开始，直到实验结束，一共69天）。因为PN出水中还含有大约480mg/L的SS，所以大多数SS都通过沉淀和过滤去除了。过滤采用日本Vilene产的无纺布聚酯纤维纸。为防止PN出水中浓度为700
11、-800mg/L的NO2N抑制厌氧氨氧化反应活性，进水要用自来水稀释10-7倍。进水与综合无机废水，达到期望的混合率（PN出水在进水中的比率）直到第73天。另外，往进水中充氮气来保证溶解氧在1.0 mg/L以下。将在另一个处理综合无机废水的厌氧氨氧化反应器中的颗粒状污泥接种6g（干重）到本反应器中。在整个操作过程中，反应器温度保持在30。是否通过减少稀释倍数和水力停留时间改变氮负荷，取决于脱氮速率。2.4 分析方法用过硫酸钾法测总氮，用分光光度法测NO2N和NO3N，用封闭回流分光光度法测COD，用红外燃烧法测TOC，在1m的玻璃纤维过滤器上，105下烘干的方法测SS，用标准方法测BOD。用改
12、进的苯酚法（邻苯基苯酚法）测定氨氮。用分光计（日本日立公司，U-2010）测定吸光度。用pH计（日本掘场，B=211）测pH值。用DO仪（掘场，OM-51）测DO。游离氨和游离硝酸浓度可通过以下式子估计：NH3（mg/L）=17/14总氨氮（mg/L）10pH/exp(6344/（273 + T)）+10pHHNO2(mg/L)=47/14NO2-N(mg/L)/exp(-2300/(273+T)10pH2.5 DNA提取和PCR扩增用ISOIL电磁流量计（日本Nippon 基因）按照生产商制定的标准提取。用Phusion高保真DNA聚合酶（Finnzaymes, 芬兰）和6F(正向引物：5-
13、GGAGAGTTAGATCTTGGCTCAG-3)真细菌引物及1492R(反向引物：5-GGTTACCTTGTTACGACT-3)真细菌引物的PCR扩充DNA中的16S rRNA基因。PCR在以下冷热循环参数下进行：最初的30s在98，后面的25个循环是：98下10s，51下20s，72下32s，最后5min在72。将扩充产物在1%的琼脂糖胶上进行电泳。切下琼脂糖胶上的一个条带（1.5kb），用Wizard 离空凝胶和PCR纯化系统（Promega,美国）提取和纯化上面的DNA。2.6 16S rDNA的克隆和测序将纯化的DNA片段连接到质粒pBluescript II KS+（Stratag
14、ene，美国）的EcoRV位点。使用组合成的质粒转化大肠杆菌DH5a。将质粒从用碱法携带它们的克隆物中提取出来。使用3130xl基因分析遗传分析仪和BigDye Terminator v3.1循环测序试剂盒（Applied Biosystems公司，美国）对DNA片段进行测序。用在NCBI网站上可得到的基本局部对比搜索工具（BLAST）程序，将本次研究测定的序列同nr数据库中的序列进行比较。本次研究测定的部分16S rRNA基因序列在DDBJ数据库里可查到。即：编号AB594203 到 AB594207（厌氧氨氧化反应器的分类操作单元2、3、4、5、6）和AB594208 到 AB594212
15、（PN反应器分类操作单元1、2、3、4、5）。3.结果和讨论3.1 部分短程硝化的性能图.2a显示了NH4N, NO2N, NO3N,随时间的变化。图.2b显示了氮负荷和亚硝酸盐的产生速度（NPR）随时间的变化。当反应器中开始通入含800-1100mg/L NH4N(稀释了两倍)的进水时，迅速生成亚硝酸盐，因为反应器中的污泥已经用试验废水驯化了300天。稀释两倍的条件下（第5-12天），出水NO2-N浓度在760-800mg/L，氨转化为亚硝酸盐的平均转化效率大约为75%。停止稀释进水。尽管进水NH4N浓度增加到了1550 mg/L，出水NO2-N浓度却几乎保持不变，PN平均转化效率达到了51
16、%。另外，PN继续保持NLR在1.6kgN/m3/d32天(第26天到第62天)。然而，在第64天的时候，加热器和空气扩散器堵塞造成的机械故障引起NPR的降低。此外，在第67天到第82天之间，pH控制计发生故障。反应器修复以后，将曝气速度从5.0mL/min增加到7.0mL/min，随着水力停留时间的减少，氮负荷也逐步增加。最后，在氮负荷为2.58kgN/m3/d时，得到最大亚硝酸盐产生速度1.65kgN/m3/d。除了最初起动阶段，整个操作过程的出水NO3N浓度都在30mg/L以下（氨转化为硝酸盐的转化效率大约为2%），这说明成功地阻止了亚硝酸盐向硝酸盐的转化。Furukawa et al. (2009)和Qiao et al. (2010a)使用硝化凝胶载体将PN系统用于处理畜禽粪便消化液，得到的结论：由于空气扩散器堵塞，不稀释进水PN是不稳定的。相反
