《应用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱源后衰变技术鉴定蛋白质》由会员分享，可在线阅读，更多相关《应用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱源后衰变技术鉴定蛋白质（9页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、应用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱源后衰变技术鉴定蛋白质项目完成单位：国家生物医学分析中心项目完成人：王杰 杨松成 吴胜明 王红霞 魏开华 张学敏摘 要 目的 ：应用 PSD 技术结合数据库检索鉴定 2DE 胶上的蛋白质斑点。 方法：用已知多 肽（ACTH ） 1839肽段和TPA被胰酶降解后的1个肽段建立了 PSD- MALDI-TOF-MS 方 法。结果 ：2DE 分离后胶上的 2 个未知蛋白质斑点应用已建立的 PSD- MALDI-TOF-MS 法分 别被明确鉴定为 40S ribosomal protein S12 和 dnaK suppressor protein。结论：PSD 技
2、术在 蛋白质组学研究中有较大的应用前景。关键词 蛋白质组学；源后衰变；基质辅助激光解析电离飞行时间质谱；肽质量指纹谱；多肽 测序一、前言蛋白质组学是当前生命科学研究的前沿领域。对蛋白质快速、准确的鉴定是蛋白质 组学研究中必不可少的关键性的一步1。采用 MALDI-TOF-MS 测得肽质量指纹谱（ PMF ）在数据库中查询识别的方式 鉴定蛋白质，是目前蛋白质组学研究中普遍应用的最主要的鉴定方法。但是，由于 PMF 鉴定结果的可靠性受诸 多因素的影响，使得部分鉴定结果往往不是十分明 确，特异性不高。多肽的氨基酸序列匹配被认为是特异性最好的鉴定方法。在蛋白 质组学研究中，利用质谱测序一般采用两种方式
3、：一种是利用串联质谱 （MS/MS ）测序；另一种是利用源后衰变（ PSD ）技术测序。应用 PSD 测序技术 鉴定经 2DE 分离蛋白质的工作，国内目前尚未见相关报道。在反射式 MALDI-TOF-MS 中，当脉冲激光照射到微量样品与饱和小分子基质 混合形成的共结晶上时，能量通过基质传递给样品，导致样品被解析电离，电离后 形成的亚稳分子离子在飞经无场区（即飞行管区）时发生裂解（其活化能来自在离 子源与基体发生的碰撞，在无场区与残留气体的碰撞，激光辐射及各种热机制等） 所产生的子离子（即源后分解碎片离子），可以通过不断改变反射器电压来进行分 离、收集并 记录于检测器，形成能为多肽和蛋白质一级结
4、构提供十分丰富而有效 的结构信息的 PSD 质谱图25 。利用 PSD 谱图，结合数据库检索可以迅速、高特 异性地鉴定蛋白质。本研究采用 MALDI-TOF-MS 的源后衰变（ PSD ）技术对促肾上腺皮质激素 （ACTH ）1839 肽段和组织型纤溶酶原激活剂（ TPA ）的酶解产物中选取的 1 个 肽段进行了序列分析方法的验证，建立了应用 PSD 技术结合数据库检索鉴定 2DE分离胶上蛋白质的方法，并应用该方法成功地对 2DE 胶上两个不同的未知蛋白质 斑点进行了明确鉴定。二、实验和方法1. 材料促肾上腺皮质激素（ ACTH ）1839 肽段为德国 Bruker 公司提供；组织型纤溶 酶原
5、激活剂（ TPA ）由广州铭康药业公司提供；经 2DE 分离后的蛋白斑点 A，B 分 别由军事医学科学院二所及八所提供；a -氰基-4-羟基肉桂酸（a -CCA , Bruker公 司）；三氟乙酸（TFA , Fluka公司）；乙腈（CAN , Fisher公司）；胰蛋白酶（Trypsin , Boehringe 公司 ）为测序级；2. 仪器德国 Bruker 公司 MALDI-TOF-MS （FEFLEX III ）；反射检测方式；飞行管长 3 m ；氮激光器：波长 337 nm 。3. ACTH 的处理：将精确称取的促肾上 腺皮质激素（ ACTH ） 18-39 肽段用含0.5%TFA的水
6、溶解配成浓度为2PmolL -1的溶液。待用；4. TPA的处理：将50p g糖蛋白（TPA）溶解在500p L25mmolL -1碳酸氢氨溶液中，加 入lpg胰蛋白酶（Trypsin） , 37 C保温反应17h。待用；经2DE分离后的蛋白斑点 A、B 的处理 胶内酶切详细方法见参考文献 6。5. 基质： 将 CCA 溶于含 0.1%TFA 的 50%ACN 溶液中,制成饱和溶液,离心,取上 清,待用；6试样分别取1吐上述四种样品待测液，各与1UL的饱和基质上清液混合，取1吐分别点在Scorce384靶上，送入离子源中进行检测。7. 结果7.1多肽ACTH （1839 ）肽段与蛋白TPA酶解
7、产物的源后衰变（PSD ）谱图的分析首先选用文献 7 报道较多的促肾上腺皮质激素（ ACTH ） 1839 肽段对其进行 了 PSD 测序，该肽段的一级结构为 RPVKVYPNGAEDESAEAFPLEF ，准分子离子的分子量 M+H +=2465. 20 。实验结果见图 1。813.123CI0.4ytisnetnino将实验所得数据经 Mascot 的 MS/MS Ion 方式检索得到唯一鉴定结果为促肾 上腺皮质激素（ ACTH ），综合评判分值 （score） 为 72分（超过 34分有效）。从结 果可以看出，在应用 PSD 技术对该肽段进行测序分析时，能够得到丰富的碎片离 子，由此可推
8、算出较多的序列信息，这也是该肽段在利用 PSD 技术测序方法学研 究中应用广泛的原因之一。在本次实验中，我们测得了两个 a 型离子的序列片段， 一段是a8a11的-GAE-，一段是a13a17的-SAEA-,另有一个含有两个残基的b型 离子序列片段b6b8的PN以及其他几个不同离子类型单个氨基酸残基。为了优化实验条件并进一步对 PSD 的测序功能进行研究,选取蛋白 TPA 酶切 后的一个肽段（ m/z2184.11 ）进行 PSD 测序分析,实验结果见图 2。1983.0 a 164 00 -500100015002000 m/z300 -.Figure 2 PSD spectra of m/
9、z2184.11 peptide from TPA after enzyme digestion and searching resultytisnetnino361 b23（12b2101.2b 1JLscore 值为 62 分（超过 42 分有效）。从结果可以看出,在乌将实验所得数据经 Mascot的MS/MS Ion方式检索得到唯一结果为组织型纤溶 酶原激活剂（TPA ）,此PSD谱图中,虽然碎片离子信息不如 ACTH 的丰富,但却测得了一段较长 b 型 离子的序列片段，即b1b6的-QMIYQ-，以及较短的一段是b8b10的-QS-。可以看出,无论是多肽样品还是蛋白的酶切肽段均可通过对
10、其所测的 PSD 谱 图进行数据库查询得到高特异性的鉴定结果。2经2DE分离后的蛋白斑点A和B的PMF谱及PSD谱分析目前，在蛋白质组学研究中，有部分经 2DE 分离的未知蛋白质样品无法通过MALDI-TOF-MS 的 PMF 得到鉴定或鉴定结果不明确，如再将 PSD-MALDI-TOF-MS 的测序功能应用于对这些蛋白质的进一步明确鉴定时， PSD 技术在蛋白质组学 研究中，将能发挥更大的作用。图 3是对经 2DE 分离后的蛋白斑点 A 用 MALDI-TOF-MS 测得的 PMF 及检索结果。10000 -ytisnetnino8000 6000 -40002000ia 42，Sigure
11、 311B9-63从图.3可以看出，此PMF.谱0PMF spectr1736,071750.98标法，利用7个标准肽段在80035O0u的质量范围之内对仪器的质量进行了校正。实验测得胰酶自切峰与理论值之间的质量误差 为 0.05u （理论上自切峰的m/z2163.05 ）， 表明所测 PMF 谱图在此质量范围内的误差很小。 但该数据经 Mascot 的 PMF 方式检索得到的结果均未超过有效值（都在阴影区），说明蛋白斑 点 A 通过 PMF 鉴定，没有获得成功。为了进一步鉴定蛋白斑点 A，选取图3中m/z 1750.98峰做PSD测序分析。实 验结果见图 4。4006008001000120
12、014001600m/z500 -ytisnetnino1264.8b 11Figure 4PSD spectra of m/z1750.98 peptide from spot A after trypsin digestion and searching result该图实验数据经 Mascot 的 MS/MS Ion 方式检索得到唯一结果为 40S ribosomal protein S12 ， score 值为 82 分（超过 37 分有效）。检索结果显示，该 肽段共有 15 个氨基酸残基，序列为 LVEALCAEHQINLIK 。在实验中测得了两个 较长的b型离子的序列片段，一段是b
13、2b7的-EALCA-, 段是b9b15的- QINLIK-。PSD谱图中未显示b1和b8离子，故而未测得该肽段的全序列。一段完整的序列，无论是对蛋白质的鉴定还是完成对全新蛋白质的基因工程表达，均具有 重要意义。因此，如果通过 PSD 测得到 1 个多肽的全序列，将更具有实际的应用价值。图 5 是经 2DE 分离后蛋白斑点B 用 MALDI-TOF-MS 测得的 PMF 谱图及检索结果。1000050001421.722043.022362.12r - I10 f養5 -OJIm：；：aSie73ItI-J9PrcOOl lltw DaR ItaMK* kcrr367S-. 74ipectra
14、of spot B 2unkf0W2prOteid2nd4searchi加 p 2豐.253犁甩从图 51可以看出，实际测得胰酶自切峰与理论值之间的质量误差为10.03u （理3 80 6. Result3290,63论上自切峰的m/z2273.160 ）。经Mascot的PMF方式检索显示有两个有效结果:dnaK suppressor protein Escherichia coli O157:H7 EDL933（ 116 分）及 dosage-dependent dnaK suppressor protein Salmonella enterica subsp. enterica sero
15、var Typhi（98 分）。检索出的这两个蛋白质的序列高度相似，只有微小的差异，此时通 过 PMF 的鉴定结果很难在这两个蛋白之间作出肯定的判断。为了得到更明确的鉴 定结果，选取图 5 中 m/z1421.72 峰做 PSD 测序分析。实验结果见图 6。图 6 的 PSD 实验结果显示了该肽段的全序列，并且是 y 型离子，该肽段共 12 个氨基酸残基，其一级结构为（R ） LELSFEEEQAA。实验数据经 Mascot的 MS/MS Ion 方式检索得到唯一结果为 dnaK suppressor protein Escherichia coli O157:H7 EDL933 ， score 值为 136 分（超过 26 分有效），实验获得了明确的鉴定 结果。三、讨论 现代生物质谱技术的发展，为鉴定蛋白质
