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1、DNA片段的回收一. 【实验目的】 1. 掌握转化的原理和方法2. 掌握T-A克隆的原理3. 掌握互补的原理和蓝白斑筛选重组子的原理和方法二. 【实验仪器与试剂】1. 实验仪器：恒温摇床、超净工作台、恒温水浴锅、恒温箱、微量取液器等2. 实验材料：连接试剂盒（PMD19-T、目的片段、Solution）、大肠杆菌感受态细胞等3. 实验试剂：LB固体培养基、氨苄青霉素（Amp）、X-Gal、IPTG等三. 【实验原理】1、 连接是指把外源DNA片段同载体连接起来。外源DNA片段同载体连接策略如下： a.把载体和DNA片段分别用同一组酶(两种不同的粘性末端限制性内切酶) 进行消化，使各自产生带有非
2、互补的粘性末端，再把二者进行连接。 b.把载体和DNA用一种相同的粘末端酶处理，使各自带有一种互补的粘性末端，再连接。 c.把载体和DNA用平端酶处理，再连接。2 、转化指把DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。其原理是细菌处于0，CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形。经过42短时间热击处理，促进细胞吸收胞外DNA。然后将细菌放在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型（如mpr等）得到表达，最后将此细菌培养物涂在含有mp的培养基上，筛选出含有外源基因的阳性克隆。3、互补E. coli TOP 10菌株带有-半乳糖苷酶C端部分序列的编码信息，pMD19-T带有-
3、半乳糖苷酶N端部分序列的编码信息。在各自独立的情况下, pMD19-T和TOP 10编码的-半乳糖苷酶的片段都没有酶活性。但在它们融为一体时，可形成具有酶活性的蛋白质。这种lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的-半乳糖苷酶阴性突变体之间实现互补的现象叫-互补。4、蓝白斑筛选由pUC19载体构建的pMD 19-T Vector含有复制起点（ori），青霉素抗性基因（Amp）以及lacZ的启动子及编码-肽链的DNA序列，并且在lacZ基因中有一段多克隆位点（MCS）区段。当外源的DNA片段插入到这些克隆位点时，使-互补链破坏形成的是无活性的-半乳糖苷酶，于是被转化的大
4、肠杆菌细胞，就在Xgal - IPTG培养基上形成白色菌落，而相反没有外源DNA插入的质粒转化大肠杆菌细胞后，在Xgal-IPTG培养基上形成蓝色菌落。这样： 不带有载体DNA的细菌未转化成功的细菌,由于无Amp抗性, 在含有Amp的筛选培养基上不能成活。 带有载体而未有插入片段的细菌，由于具有-半乳糖苷酶活性, 在X-gal和IPTG培养基上为蓝色菌落。 带有重组质粒的细菌，由于插入DNA片段，导致丧失了-半乳糖苷酶活性,在含有x-gal和IPTG培养基上为白色菌落。四. 【实验内容与步骤】1、连接 （1）在微量离心管中配制下列DNA溶液，全量 为10l。 pMD19-T Vector 0.
5、5 l Insert DNA 4.5l （在进行克隆时，Vector DNA和Insert DNA的摩尔比一般为：1 ：210） （2）加入5l（等量）的 Solution。 （3）16反应过夜。2、转化 （1） 将连接产物10l加入到100l的感受态细胞里（50l感受态细胞需25ng DNA)，轻轻旋转以混匀，冰上放置30分钟。 （2） 42水浴90s不要摇动。 （3） 冰浴中放置2-5分钟。 （4） 每管中加入400l 37 预温LB培养基，37摇床80-120rpm温和振荡40分钟。3、重组子的验证（1） 制备含氨苄青霉素的琼脂平板 。（2） 取100l菌液,加入X-gal 20l和10
6、l IPTG，然后平铺在含有氨苄青霉素的琼脂板，用无菌玻璃涂布器轻轻将细菌涂在平板表面，将平板置于37培养15分钟。（3）倒置平板于37培养12-16小时可出现菌落。（4）取出培养板于4放置数小时，使蓝色在这一期间充分显色。五. 【实验结果与讨论】现象描述及分析本实验菌落涂布均匀，生长较好，且重组体数量多，仅有少量的非重组体。实验较成功。附图 六. 【思考题】 1.蓝白斑筛选中X-gal和IPTG的作用分别是什么？X-gal：5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷 ，是半乳糖苷酶的底物，水解后呈蓝色，可以根据是否呈现白色菌落而方便地挑选出基因重组体。IPTG：异丙基硫代半乳糖苷，是半乳糖苷酶的
7、活性诱导物质2.蓝白斑筛选中可能出现的结果有哪几种，简要说明出现的原因。一般来说，使用蓝白斑筛选法，在涂布有IPTG和X-Gal的筛选平板上，重组菌株为因为在白色，未转入重组质粒的菌株为蓝色。原因：由pUC19载体构建的pMD 19-T Vector含有复制起点（ori），青霉素抗性基因（Amp）以及lacZ的启动子及编码-肽链的DNA序列，并且在lacZ基因中有一段多克隆位点（MCS）区段。当外源的DNA片段插入到这些克隆位点时，使-互补链破坏形成的是无活性的-半乳糖苷酶，于是被转化的大肠杆菌细胞，就在Xgal - IPTG培养基上形成白色菌落，而相反没有外源DNA插入的质粒转化大肠杆菌细胞后，在Xgal-IPTG培养基上形成蓝色菌落。有时还会有假阳性的情况出现，此时白色菌落不是重组体，而蓝色菌落是重组体。原因：进行酶切后连接时，酶切位点几个碱基缺乏，读码框架改变，亚基失效。此时白斑不是重组体。当插入外源基因很小时，读码框架没有改变，不影响亚基，重组体显示蓝色。
