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1、高通量原位杂交新技术及其在HER 2基因CISH法检测中的应用摘要 目的：创立一种高通量原位杂交技术以提高检测效率和减少试剂用量， 以解决当前原位杂交技术临床应用费用高通量低的痛点。方法：将待检组织细胞 样品制备成薄膜载片放入微孔板中，在定制的微孔板杂交仪中完成杂交反应。结 果：通过对乳腺癌和肺癌HER 2基因的检测证实了该方法经济高效结果可靠。结 论：采用薄膜载片微孔板检测系统进行高通量原位杂交可以将12个载玻片的杂 交仪的检测通量提高至19 2个，同时单个样本节省8 0%的试剂用量。原位杂交技术（in situ hybridization, ISH）在生命科学领域应用广泛，尤其在药物 靶点
2、检测和遗传病诊断等方面具有重要的应用价值，被公认为靶向治疗基因靶点 检测的金标准。但由于原位杂交所用的分子探针价格昂贵和现有原位杂交仪检测 通量低，并且操作步骤繁杂，临床上往往并不作为药物靶点检测的首选方法。为 此，我们研发了高通量的原位杂交检测系统，在提高检测效率的同时降低了检测 成本，并在肿瘤组织HER 2基因靶点的检测中得到了验证。用于肿瘤组织药物靶点检测的原位杂交技术，根据其信号发生原理的不同，目前 主要分为荧光原位杂交（FISH），显色原位杂交（CISH）和银染原位杂交（SISH） 三种。以HER2基因靶点检测为例，FISH法HER2检测临床已应用多年，积累了比 较多的案例和数据，检
3、测结果准确性高和重复性好，故被确定为金标准。为了验 证我们高通量原位杂交技术的实际效果，我们选用经过FISH法检测过HER 2基因 靶点的乳腺癌和肺癌病理样本79例，采用薄膜载片微孔板高通量技术通过CISH 法复检上述肿瘤组织HER 2基因的扩增情况，以检验本系统的实际应用效果。现 将高通量原位杂交新技术及其检测结果报告如下。1 .材料与方法1 .1实验材料 选择浙江省宁波市第六人民医院病理科经过 FISH 法检查过的乳 腺癌和肺癌石蜡病理组织块，用透明耐高温的塑料薄膜作为组织切片的载体，捞 片之后脱蜡水化， HE 染色后镜下选取乳腺浸润性导管癌患者肿瘤细胞浸润部位进 行标记，然后用特制的打孔
4、器取下被标记的圆形组织片，放入定制的多孔板中。1.2实验方法 仪器和试剂 1）HER2/CEN17双显色分子探针购自Zy to Vision GmbH公司，与HER 2基因杂交最后显深绿色，与CEN 17杂交的显浅红色。2）高通量原位杂交仪由宁波吉聚生物科技有限公司生产。 观察实验结果所用的光学显微镜型号为OlympusCX31。1.3实验步骤 杂交前：1）薄膜组织切片的制备：选用耐高温不变形的塑料薄 膜作为组织切片的载体，捞片后进行烤片70Cx10min; 2）脱蜡和水化：组织切片 依次放入二甲苯（xylene2x5min）和梯度酒精（100%乙醇x5min, 90 %2x5min,70%2
5、x5min;）。3）过氧化氢灭活内源性酶3%H2O2x5min; 4）蒸馏水洗3 遍；5） EDTA杂交前处理液x15min； 6）立即蒸馏水洗3遍。7）加胃蛋白酶消化 液于组织切片上，室温中3-10 min （保湿条件）；8）蒸馏水洗3遍；9） 70%， 90%和100%乙醇X1min；空气中晾干。杂交过程1） Vortex （混悬震荡）探针 工作液，加5微升原位杂交探针工作液于癌组织切片上，充分覆盖组织，避免气 泡； 杂交过程：置高通量原位杂交仪上微孔板中，设置80CX5min 37CX12小 时过夜；杂交后：1）次日备2缸SSC冲洗液，其中1缸预热至80C，先用室 温SSC冲洗液，再用预
6、热SSC冲洗液浸泡组织杂交片5mi n；2 ）蒸馏水洗2x1min；3 ） 1x TBS缓冲液（0.025%Twee n20 / PBS）洗3遍；封闭液封闭组织杂交片1 0 mi n; 4 ）滴加鼠抗地高辛DIG/兔抗DNP抗体（一抗）工作液1 0微升 /片，37Cx30min或室温60min；5） TBS洗3遍；6）滴加HRP/AP标记的抗鼠和抗兔抗体（二抗）混合工作液37Cx15min或室温30 mi n；7 ）孵化期间将 AP-Red A（30 微升） 和 AP-Red B（970 微升）混合（避免强光）待用；8） TBS3x1min冲洗；9 ） AP-Red混合液室温10min;1 0
7、）孵化期间将HRP- GreenA（40 微升） 和 HRP- GreenB （960 微升）混合（避免强光）待用； 11 ） 蒸 馏水洗2x1min； 1 2 ） HRP-Green混合液切片上室温10min； 1 3 ）蒸馏水洗2x1min； 16）核绿（Nuclear Blue）染液 2min； 1 4 ）流水洗 2min; 15）封片；1 6）光镜 下观察计数。检测结果判断标准：选择细胞核大小一致无重叠，且边界完整信号清晰的浸润癌 细胞进行计数，随机计数30个浸润癌细胞核的双色信号，其中绿色信号代表 HER 2基因，红色信号代表CEN17 ；计算这些细胞核中绿色信号之和与红色信 号之和
8、的比值，若比值大于2则结果为阳性，表明肿瘤组织HER 2基因扩增；若 比值小于2但平均每个癌细胞HER 2绿色信号计数大于/等于6亦为阳性。若绿色信号之和与红色信号之和的比值小于2且平均癌细胞HER 2绿色信号数小 于2则为阴性，表明组织细胞没有HER 2基因的扩增；若比值小于2,平均癌细 胞HER 2绿色信号数介于4 6之间，则需另外计数30个浸润癌细胞重新进行 统计。然后对结果进行最终判断。结果和讨论结果:在 50 例 FISH 法 HER2 检测阳性的肿瘤组织标本中,经高通量 CISH 法复检发 现有49例CISH呈现HER2基因高倍扩增，仅1例显示无扩增；CISH法与FISH法在 HE
9、R2 基因扩增的检测上符合率为 98%。另 29 例 FISH 检测 HER2 表达为阴性的标 本中，经高通量 CISH 复检 HER2 基因扩增情况与 FISH 符合率为 100%。高通量 CISH 与 FISH 的总体符合率为 98.7%,与国外文献报道（1.2）， CISH 与 FISH 的检测 结果的整体符合率为 96%的结果相近似, 可见高通量 CISH 法是检测 HER2 基因扩 增的一项实用可靠的新技术。二者明显相关（P0.001）。结论:采用高通量原位杂交 仪进行 CISH 法检测乳腺癌 HER2 基因扩增的结果与 FISH 法检测的结果符合率高度 一致。与以往的检测方法相比，
10、高通量原位杂交检测技术单次检测通量增加 16 倍，单个样品分子探针的用量减少 80%以上。大大降低了检测成本并提高了检测 效率。可作为乳腺癌 HER2 基因检测的一项新技术;但在具体操作时,应注意严格控 制切片厚度、消化时间及杂交后洗涤温度与时间等因素。讨论：由于妇女乳腺癌的发病率居高不下，且有逐年增长的趋势，精确检测肿瘤 细胞HER 2基因状态对于患者的精准治疗和预后判断十分必要，因此美国病理医 师协会建议所有乳腺癌患者均需检测HER 2靶点，目前HER 2蛋白靶点的检测主 要通过免疫组化染色（IHC）来完成，HER 2基因靶点的检测主要通过荧光原位杂 交（FISH）来判定，前者成本低，但假
11、阳性和假阴性高，适合于病患的初筛；而 后者成本高，准确性也比较高，故成为HER 2靶点检测的金标准，但病理样本的 荧光染色不能长期保存。 CISH 技术具有敏感准确，重复性好，样本可长期保存， 成本介于 IHC 和 FISH 法之间等诸多优点（3.4.5.6.7），未来有望替代 IHC 和 FISH 法成为HER 2检测的首选，更由于采用原创性的高通量薄膜载片多孔板检测系统, 每张病理样品的分子探针用量节省 50%以上，在研究中我们注意到，由于我们使 用的是显色双染 CISH 探针同时观察红色和绿色信号，绿色的 HER2 信号可能覆盖 红色的着丝粒信号，或者出现相反的情况，都会导致 HER2
12、计数偏多或偏少的情 况，导致HER2检测假阳性或假阴性的可能。扩增程度越高，HER2/CEN17的比值 偏差越大。由于FISH是在油镜下观察(100倍)，信号点会比CISH的40倍或60 倍更大、更清晰和容易观察。并且， FISH 可用不同滤片观察不同颜色，信号不易 被遮挡，因此计数会更加准确，特别是不同颜色的信号重叠时。因此在临界比值 样本中，CISH由于信号重叠，可能会有较大的比值偏差，需要用FISH进一步确认。 临床实践表明对 CISH 计数的技术人员要求更高，已经熟悉 FISH 计数的技术人员 还需进行进一步培训才能胜任CISH计数的工作，需要掌握明场视野下的组织学知 识才能识别肿瘤细
13、胞，完成 CISH 计数。这也是 CISH 相对 FISH 比值低的一个原因。 操作过程中应严格控制切片厚度和酶的消化时间，一般要求切片厚度为45ym，酶 的消化时间控制在5 分钟;切片越厚消化时间越长。杂交变性要彻底,杂交后的洗 涤温度和时间也很重要，最好控制在7075C;每次实验最好有阳性对照片，可以有 效进行质量控制。1F.E. Rosa, R.M. Santos, S.R. Rogatto, and M.A.C. Domingues Chromogenic in situ hybridization compared with other approaches to evaluate
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