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1、第八章 免疫学技术 第一节 抗原抗体的制备一、抗原的制备制备特异性的抗原是制的合格抗体的前提条件，而作为检测诊断的抗原也必须是纯化的抗原。抗原的物质很多，很少是单一成分，必须从复杂的组分中提取分离。按抗原的物理状态，可分为天然抗原、人工抗原和合成抗原三类。1、天然抗原的制备（1）颗粒性天然抗原常见的颗粒抗原包括动物、植物、微生物的细胞，和有关的细胞组成结构，如细胞的细胞壁、线粒体，细菌的鞭毛和菌毛等。一般步骤为：首先收集抗原细胞或（和）扩增培养，然后离心或过滤收集细胞或细胞组成结构物，再进行病原微生物灭活。（2）可溶性抗原的分离纯化蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶、补体、细菌毒素、免疫球蛋白片段、核
2、酸等皆为良好的可溶性抗原，免疫前常需纯化。 细胞破碎方法有：冻融法；超声破碎；高速组织捣碎机法；研磨法；溶菌酶、蜗牛酶、纤维素酶处理 可溶性蛋白抗原的分离方法：离心分离法：差速离心、密度梯度离心选择沉淀法：盐析沉淀法；有机溶剂沉淀法，常采用乙醇或丙酮核酸去除法，DNA酶、RNA酶处理；水溶性非离子型聚合物沉淀法：常用非离子型聚合物为分子量为20006000的聚乙二醇（PEG）凝胶过滤法 ：又称分子筛层析。通过凝胶分子筛作用，可将大、中、小三类分子分开，选择凝胶柱时应注意选用适于分离范围内的凝胶。 离子交换层析法：离子交换层析是利用一些带电离子基团的凝胶或纤维素吸附带有相反电荷的蛋白质抗原。亲和
3、层析法：亲和层析是利用生物分子间所具有的专一性亲和力而设计的层析技术。如抗原和抗体、酶和酶抑制物、酶蛋白和辅酶、激素和受体、DNA和RNA等之间有特殊亲和力，一定条件下，两者可紧密结合成复合物，如将复合物的一方固定于固相载体上，则可从溶液中分离和提纯另一方。 纯化抗原的鉴定 主要对纯化抗原的含量、理化性质、纯度及免疫活性进行鉴定，常用方法有酚试剂法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法、免疫电泳法、免疫双扩散法等。2、人工抗原的制备人工抗原指经过人工修饰的半抗原，即将半抗原与载体连接后形成的完全抗原。小分子半抗原可以是多糖、多肽、核酸、类固醇激素、某些药物及其它化学物品。在食品检验中常见的小分子半抗原有各种农
4、药、兽药、添加剂与非法添加物（盐酸克伦特罗）、真菌毒素等等。常用载体：蛋白质、多肽聚合物、大分子聚合物。蛋白质：常用牛血清白蛋白（bovine serum albumin,BSA）、卵清白蛋白（OVA）、人血清白蛋白（HSA）、兔血清白蛋白（RSA)。 多肽聚合物：常用多聚赖氨酸。 大分子聚合物：聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、羧甲基纤维素(CMC)等皆可与半抗原结合，加入弗氏佐剂课产生良好的抗体。连接方法：物理法 是用物理吸附法将载体与半抗原连接，其原理是通过电荷和微孔来吸半抗原，吸附载体主要有PVP和CMC等；化学法 是利用某些功能基团把半抗原连接到蛋白质类或多肽类聚合物载体上。不同的半抗原应选
5、用不同的方法进行连接。根据半抗原拥有的化学基团不同，连接方法主要有以下几类：带游离氨基或羧基以及二种基团皆有的半抗原：羧基可用混合酸酐法和碳二亚胺法与载体氨基形成稳定的肽键，带氨基的半抗原则可与载体羧基缩合。带有羟基、酮基、醛基的半抗原：不能直接与载体连接，需要用化学方法如琥珀酸酐法、O-（羧甲基）羟胺法等方法将之转变为带有羧基的半抗原衍生物后才能与载体连接。带有酚基的半抗原：可用一氯醋酸钠法或重氮化的对氨基苯甲酸法，生成带有羧基的半抗原衍生物。3、免疫佐剂某些物质与抗原一起或先于抗原注入机体，可增强机体对该抗原的特异性免疫应答或改变免疫应答类型，此类物质称为佐剂(adjuvant) 。 应用
6、最多的佐剂为福氏佐剂福氏不完全：石蜡油+羊毛脂福氏完全：石蜡油+羊毛脂+卡介苗乳剂的制备：乳剂：抗原与佐剂的混合物抗原与佐剂的比例为1:1，注射前要充分乳化二、多克隆抗体的制备1、免疫动物的选择选择动物时应考虑以下因素： 抗原来源与动物种属的关系。抗原的来源与免疫动物种属差异越远，其免疫源性越强，免疫效果越好，而同种系或亲缘关系越近，免疫效果越差。 动物个体的选择。适龄、健康、体重符合要求的正常动物（以雄性为佳）； 抗体的用途和量：抗体需要量少时，选用家兔、豚鼠和鸡等小动物；抗体需要量大时，可选用绵羊、山羊、马、驴等大动物。2、免疫方法选定动物后，在免疫过程中应考虑免疫剂量、免疫途径、免疫次数
7、、免疫间隔等因素。痹。（1） 免疫原的剂量：免疫原的接种剂量按免疫原性的强弱、动物的个体状态和免疫时间来确定。小鼠首次剂量50-400 ug/次。大鼠：100-1000 ug/次。兔子：200-1000 ug/次。加强免疫剂量为首次剂量的1/5-2/5。（2） 免疫途径与免疫间隔时间免疫途径通常有皮内、皮下、肌肉、静脉、腹腔、淋巴结等，视不同的免疫方案而异。对于不易获取的宝贵抗原可采用淋巴结免疫法。 免疫间隔时间是影响抗体产生的重要因素，其中首次与第二次免疫的间隔时间尤为重要，一般以23周为佳，二次后间隔时间一般为1周，若间隔时间太长，则刺激减弱，抗体效价不高。 3、动物采血采集免疫血清前，要
8、预先测试抗体效价测定，若效价达到要求，应在末次免疫后一周及时采血，否则抗体效价会下降。 (1) 颈动脉采血法 (2) 心脏采血法 (3) 静脉采血法4、免疫血清的鉴定（1） 效价的测定 效价，又叫滴度，是稀释度的倒数，指通过血清学方法能显示一定反应的抗体或抗血清的最高稀释倍数，如终点稀释度为1/100，效价 (每1ml的血清中抗体效价)为100抗体单位。颗粒性抗原可采用凝集试验。 可溶性抗原常用双向免疫扩散试验、ELISA等方法。（2）特异性的鉴定 抗体特异性鉴定常用双向免疫扩散法、免疫电泳法。（3） 纯度的鉴定 抗体纯度的鉴定可采用SDS-聚丙酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、双向扩散试验、
9、免疫电泳等方法。（4） 亲和力的鉴定 抗体结合部位与抗原表位之间结合的强度。 测定抗体亲力的方法较多，如平衡透析法、ELISA或RIA竞争结合试验等。5、免疫血清的保存 （1）4保存（6个月）（2）低温保存（-70 -20 ，5年）（3）真空干燥保存（5 10年）注意点：保存前需经除菌 保存液含防腐剂 避免反复冻融（分装）三、单克隆抗体的制备单抗：由一个识别单一抗原决定簇（表位）的B细胞克隆所产生的同源抗体。单抗制备过程1、致敏淋巴细胞的准备2、骨髓瘤细胞的准备3、饲养层细胞的准备4、细胞融合5、选择性培养6、特异性抗体的检测7、杂交瘤细胞的克隆化8、杂交瘤细胞的冻存与复苏9、单克隆抗体的大量
10、制取10、单克隆抗体的纯化第二节 抗原抗体反应抗原-抗体反应（antigen-antibody reaction）是指抗原与相应抗体在体内或体外发生的特异性结合的反应。 血清学反应（serological reaction）指体外的抗原-抗体反应。一、抗原抗体反应的原理（1）抗原抗体亲和力静电引力（electrostatic forces）范德华引力:作用最小（van der Waals interactions）氢键:最具特异性（hydrogen bond ）疏水作用力:作用最大 （hydrophobic interactions） （2）抗原抗体亲水胶体转化为疏水胶体抗体、大多数抗原亦为蛋
11、白质，在水中皆为胶体溶液，不会发生自然沉淀。抗原抗体结合使电荷减少或消失，蛋白质由亲水胶体转化为疏水胶体。如再加入电解质，则进一步使疏水胶体物相互靠拢，形成可见的抗原抗体复合物。二、抗原-抗体反应特点1、特异性特异性：抗原与抗体结合反应的专一性分子基础：抗原表位与抗体分子高变区之间化学结构和空间构型的互补。2、可逆性可逆性：抗原与相应抗体结合成复合物后，在一定条件下又可解离为游离抗原与抗体的特性 影响因素： 抗体对相应抗原的亲和力亲和力越高，结合越牢固，越不易解离 环境因素对复合物的影响pH、离子强度 3、比例性比例性：抗原与抗体发生可见反应需遵循一定的量比关系前带(prezone)：抗体过量
12、后带(postzone)：抗原过量等价带(equivalence zone)：抗原抗体比例合适4、阶段性 第一阶段：特异性结合阶段，反应快，不可见。 第二阶段：反应可见阶段，反应慢，出现凝集、 沉淀和细胞溶解等现象。 三、抗原-抗体反应类型反应类型实验技术非标记凝集反应直接凝集试验、间接凝集试验、间接抑制凝集试验、协同凝集试验沉淀反应液相内凝集试验、凝胶内凝集试验补体参与的反应补体溶血试验、补体结合试验中和反应病毒中和试验、毒素中和试验标记标记免疫反应荧光免疫技术放射免疫技术酶免疫技术发光免疫技术金免疫技术第三节 非标记免疫分析技术 一、凝集反应（agglutination）细菌、红细胞等颗粒
13、性抗原与相应抗体结合后形成肉眼可见的凝集块现象，称为凝聚反应。用于凝集反应中的抗原称凝集原(agglutinogen)。用于凝集反应中的抗体称凝集素（agglutinin)。1. 直接凝集反应颗粒抗原与抗体直接结合玻片法：细菌及ABO血型鉴定试管法：2. 间接凝集反应 抗原（或抗体）吸附于载体+相应抗体（或抗原）凝集 常用载体：乳胶颗粒、羊红细胞二、沉淀反应(precipitation) 沉淀反应指可溶性抗原与其相应的抗体在合适条件下反应并出现沉淀物的现象。 用于沉淀反应中的抗原称沉淀原(precipitonogen)。 用于沉淀反应中的抗体称沉淀素（precipitin) 。 1. 液相内沉
14、淀环状沉淀反应：小试管内，下层沉淀素与上层沉淀原在界面应，形成白色沉淀环。絮状沉淀反应：抗原抗体溶液混合，在电解质存在下，两者结合出现可见的絮状沉淀。2. 凝胶内沉淀（1）单向琼脂扩散试验 是将一定量已知抗体混于琼脂凝胶中制琼脂板，在适当位置打孔后将抗原加入孔中扩散。抗原在扩散过程中与凝胶中的抗体相遇，形成以抗原孔为中心的沉淀环，环的直径与抗原含量成正比相关。本法常用于测定血清IgG、IgM、IgA 和 C 3等的含量（2）双向免疫扩散 是将抗原与抗体分别加入琼脂凝胶的小孔中，二者自由向周围扩散并相遇，在比例合适处形成沉淀线。如果反应体系中含两种以上的抗原抗体系统，则小孔间可出现两条以上的沉淀线。本法常用于抗原或抗体的定性 、组成和两种抗原相关性分析的检测。（3）对流免疫电泳是先将待侧血清标本作琼脂凝胶电泳，血清中各蛋白组分被分成不同的区带，然后与电泳方向平行挖一小槽，加入相应的抗血清，把分成区带的蛋白抗原成分作双向免疫扩散，在各区带相应的位置形成沉淀弧。该法常用于血清蛋白种类分析，以观察Ig的异常增多或缺失。（4） 火箭电泳 将单向免疫扩散与电泳技术结合，可快速测定标本中可溶性抗原的含量。（5）免疫比浊法 该技术是利用抗原抗体复合物在液相中形成浊度来测量抗原含量的方法。方法： 透射光比浊法
