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1、291-国家重点基础研究发展计划国家重点基础研究发展计划（973计划）课题任务书项目名称：生物固氮作用的分子机理研究课题编号：2010CB126502课题名称：根瘤菌固氮系统调控的分子机理中华人民共和国科学技术部制2010-1一、研究内容根瘤菌-豆科植物共生固氮作用的研究主要包括两个生理学过程：即：结瘤和固氮。有关早期根瘤的发生、发展和形成过程中微生物与植物相互识别、信号分子间相互作用的研究，近年来取得了突破进展。然而，在共生体形成过程中早、中、晚期根瘤菌与宿主植物相互作用的研究仍缺乏系统性。尽管在根瘤菌、豆科植物都积累了大量的结瘤不固氮（nod +fix -）的突变体，但其关键的功能基因及其
2、调控机制都不清楚，如：豆科植物中根瘤菌共生信号转导机制、根瘤中类菌体分化、固氮和衰老等生理过程有关的功能基因、信号分子、及与宿主相互作用的调控机制等。本课题广泛和深入开展根瘤菌固氮系统调控的分子机理研究，在分子水平上探讨低等微生物与高等植物遗传信息是如何交流的？共生固氮体系是如何建立的？固氮功能是如何发挥的等关键科学问题，将为提高生物固氮效率、扩大根瘤菌寄主植物范围、为探索建立非豆科植物共生体系提供科学依据。同时，为共生固氮在农业生产中的应用提供理论基础和技术支撑。主要研究内容如下：1、苜蓿中华根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）LysR和GntR转录因子家族中共生固氮必需基
3、因的作用及其调节机理：双组份系统（组氨酸激酶和反应蛋白）调节根瘤菌细胞周期相关基因表达的分子机理。通过基因敲除技术，构建苜蓿中华根瘤菌共生固氮必需的LysR家族转录因子LsrA和LsrB以及GntR家族转录因子GtrA和GtrB基因的缺失突变体，考查不同突变体的共生固氮表型；通过基因芯片技术，分离和鉴定出不同转录因子所调控的下游靶基因，研究苜蓿中华根瘤菌双组份调节系统在自生和共生条件下的作用机制和功能，阐明根瘤菌代谢与共生固氮功能的相关性和调控机理，为改造和提高共生固氮效率奠定理论基础。2、根瘤菌型分泌系统、群体感应系统及胞外多糖合成基因表达调控系统在共生固氮过程中的作用机理：根瘤菌具有侵染豆
4、科植物形成共生固氮根瘤，除了产生结瘤因子和植物因素外，还具备有病源细菌的特性，如分泌特殊蛋白的分泌器-型分泌系统（T3SS）、群体感应系统、产生丰富的胞外多糖等。本研究以广谱根瘤菌NGR234(Rhizobium sp. NGR234)为材料，鉴定出根瘤菌型效应因子（NopM, y4lO, NopL, NopP and NopT）分泌出去的新蛋白，并通过酵母双杂交技术鉴定与根瘤菌型效应因子相互作用的植物靶蛋白，阐明其作用机制。在根瘤菌NGR234中，各种突变体显示聚糖酶ExoK通过酶切降解胞外多糖（EPS）从而产生具有共生活性的胞外寡糖（EOS）。exok基因的突变使根瘤菌失去了在多种豆科植物
5、上形成固氮根瘤的能力，为了进一步阐明其作用机制，通过EOS（ExoK）依赖的根瘤菌 NGR234与模式植物百脉根的共生，利用蛋白质组学和DNA微阵列技术，从百脉根中鉴定出受EOSs诱导调控的基因。通过RNA干扰技术敲除基因活性可以阐明这些基因在共生过程中的功能。 3、类菌体及其与宿主方控制类菌体分化、固氮、衰老的功能基因组研究：以模式豆科植物共生固氮体系为材料，利用蛋白质与蛋白质、蛋白质与DNA、蛋白质与RNA的相互作用，建立根瘤菌与宿主植物共生关系建立早期蛋白相互作用网络。分离和鉴定参与根瘤菌结瘤因子信号传递的调控元件及基因，研究植物响应根瘤菌结瘤因子的作用方式、传递途径及其信号蛋白的调控机
6、制。阐明小G蛋白Rop6、MAPKK、SIP1、CIP73等蛋白及转录因子在共生信号接受和传递中的功能和作用机理。分离和鉴定根瘤菌-宿主共生双方控制类菌体分化、根瘤固氮和根瘤衰老的系列功能基因和信号物，阐明dmtH，opa22, lpsH基因对华癸中生根瘤菌类菌体分化和根瘤发育的调控作用。通过对豆科植物与根瘤菌、AM真菌共生的异同以及与非豆科植物比较基因组学研究，揭示非豆科植物中存在哪些与共生相关基因的功能及调控机制，为探索扩大根瘤菌寄主范围和建立非豆科共生固氮途径可能性提供科学资料。 4、根瘤菌生物多样性及其环境与固氮作用的关系：充分利用我国根瘤菌和豆科植物的资源优势，广泛开展根瘤菌生物多样
7、性的研究。结合我国西部开发，研究抗逆共生固氮体系的分子机理，筛选和构建高效、抗逆共生固氮体系。在理论上阐明根瘤菌自身代谢调控系统（如：分泌系统（T3SS）、群体感应系统、产生丰富的胞外多糖等）在不同环境条件下的功能和作用机制，揭示根瘤菌环境适应性与竞争结瘤之间的相关性，为我国西部草场建设和荒漠化改造的提供配套资源。 二、预期目标1、建立类菌体分化与固氮根瘤发育过程中根瘤菌与宿主植物间蛋白相互作用网络，分离和鉴定根瘤菌-宿主共生体系双方控制类菌体分化、共生固氮和根瘤衰老的功能基因、调控蛋白及信号分子20-30个，阐明各功能基因的结构与功能及其调控机制。为揭示根瘤菌与宿主植物在共生中、晚期相互作用
8、的分子机制提供科学资料。在根瘤菌共生信号传导方面，分离和鉴定参与结瘤因子信号转导的功能基因及其调控蛋白20-30个，建立根瘤菌共生信号在豆科植物中接受、传递及其调控的蛋白质相互作用网络。通过对豆科植物与根瘤菌、AM真菌共生的异同以及与非豆科植物比较基因组学研究，阐明非豆科植物中存在哪些与共生固氮相关基因的功能及调控机制。2、建立根瘤菌组学研究平台，在自生和共生条件下开展根瘤菌共生固氮基因组、转录组、蛋白组和代谢组学的研究，分离和鉴定LysR、GntR等家簇转录因子及靶基因30-50个，阐明根瘤菌代谢与共生固氮功能的相关性和调控机理，为改造和提高共生固氮效率奠定理论基础。3、分离根瘤菌群体感应系
9、统、型分泌效应子及胞外多糖等与共生相关基因20-30个，阐明这些基因在不同环境条件下的功能和作用机制，揭示根瘤菌环境适应性与竞争结瘤之间的相关性，为生物固氮在农业生产中的应用提供理论基础和技术支撑。4、积极参与国际竞争，在SCI收录的国际刊物上发表论文30篇（影响因子2.0以上）或达到相应的影响因子总数的文章数目。申请国内外发明专利2-3项，在生物固氮研究领域造就一支高水平的研究队伍，培养博士研究生30名以上。三、研究方案及技术路线课题总体研究思路：以豆科植物共生固氮体系为模型，从固氮微生物和宿主植物两个方面开展共生及固氮相关的功能基因组、蛋白质相互作用组、代谢组及网络调控机理研究。重点开展根
10、瘤菌共生信号在宿主植物中转导机制的研究，在宿主植物中分离与共生信号传递功能基因的调控元件及主控基因，并阐明其调控机制，以解决豆科植物与根瘤菌共生关系是如何建立的关键科学问题。在此基础上，开展豆科植物与非豆科植物间比较基因组学研究，揭示根瘤菌共生体和菌根共生体形成的异同，从非豆科植物中分离和鉴定出与共生相关的功能基因和关键调控基因，为改造和建立非豆科植物与根瘤菌共生体系提供理论依据。课题工作安排：1) 围绕豆科植物中根瘤菌共生信号转导途径分离和鉴定与之相关的重要功能和调控基因。利用蛋白质与蛋白质、蛋白质与DNA、蛋白质与RNA的相互作用，建立根瘤菌与宿主植物共生关系建立早期蛋白相互作用网络。2)
11、 通过根瘤菌突变体和（差减）文库构建策略、微阵列和蛋白组学技术，比较研究根瘤菌（自生）和类菌体（共生）的全局基因表达谱，分离和鉴定根瘤菌-宿主共生体系双方控制类菌体分化、共生固氮和根瘤衰老功能基因、调控蛋白及信号分子。3) 利用酵母双杂交、RNAi干扰和超表达、毛根转化等技术，研究根瘤菌在自生和共生条件下（类菌体）各功能基因的结构与功能及其调控机制。4) 用根瘤菌和AM真菌分别感染豆科植物并建立基因表达谱，比较研究两种不同类型共生体的功能基因及调控基因的异同，通过与被AM真菌感染非豆科（如水稻）基因表达谱的比较分析，鉴定非豆科植物中与共生相关的功能基因，研究植物与微生物共生所产生的其他特殊根形
12、态发育（如菌根）与豆科根瘤形成的分子调控机理。课题技术路线：课题创新性：1)本课题以根瘤菌与豆科植物共生固氮体系为主线，开展微生物与植物相互作用的研究。在共生关系建立方面，以宿主植物中根瘤菌结瘤因子信号转导为突破口，重点研究共生信号转导过程中网络调控机制。目前，国际共生固氮研究领域只发现钙离子作为第二信使参与豆科植物共生信号转导，在我们前期的研究中发现了小G蛋白Rop、MAPKK、E3-ligase等与信号转导相关的调控蛋白，以及ARID、Myb-SANT类转录因子。首先阐明这些调控蛋白的结构和功能，建立共生信号转导调控网络，将为揭示豆科植物与根瘤菌早期共生关系的建立提供分子基础。2)根瘤菌-
13、豆科植物共生固氮作用主要包括2个生理过程：即结瘤和固氮。目前，国际共生固氮研究主要集中在共生过程的早期阶段，而对中、后期共生和固氮过程研究甚少。本课题利用现代分子生物学研究技术，通过各种组学平台，分离和鉴定控制根瘤菌类菌体分化、根瘤发育和衰老的关键功能基因及其调控系统，阐明类菌体固氮功能基因表达和网络调控的分子机理，揭示宿主植物在逆性环境条件下与根瘤菌的应答机制。为提高共生固氮效率、增强根瘤菌竟争性和建立抗逆高效共生固氮体系提供科学依据和有效途径。课题可行性： 1) 在根瘤菌共生信号在宿主中传递及网络调控机制研究方面完善和建立了以百脉根模式豆科植物为对象的研究系统：构建了模式豆科植物百脉根根和
14、紫云英的酵母双杂库。克隆了百脉根共生信号传递的所有功能基因（NFR1、NFR5、SYMRK、CASTOR、POLLUX、CCaMK、NSP1、NSP2、NIN），并分别利用这些基因为诱饵，从百脉根中分离出一批与之相互作用的调控蛋白和基因。首次在百脉根中鉴定到与结瘤因子受体激酶NFR5相互作用小G蛋白ROP6，而且该基因的表达依赖于根瘤菌的感染和结瘤因子，并在结瘤因子信号转导中起关键的调控作用。通过蛋白质间的相互作用，证实了百脉根结瘤因子受体NFR1和NFR5蛋白间的相互作用并与小G-蛋白ROP6形成三者间的蛋白复合体，Rop6的酶活性受NFR5的调控。同时，分离到与共生受体激酶SymRK相互作
15、用的ARID转录因子（SIP1）、有丝分裂原激活蛋白酶（MAPKK）。利用蛋白与蛋白、蛋白与DNA间的相互作用，证实了SIP1转录因子直接受SYMRK的调控而结合启始结瘤基因NIN的启动子，控制启始结瘤基因的表达。MAPKK底物磷酸化活性则受SYMRK蛋白的影响。在百脉根共生信号传递途径中，有可能发现作为第二信使的调控蛋白和转导途径，阐明共生信号转导网络调控机制，在共生固氮研究领域取得突破性进展。2) 在根瘤菌类菌体分化、固氮调控、根瘤衰老相关基因研究方面构建了华癸中生根瘤菌Tn5-mob-sacB转座子突变体库，并克隆和鉴定出5个参与类菌体分化、固氮和根瘤发育的功能新基因。其中gstH基因属于谷胱苷肽S-转移酶（Glutathione S-transferase）家族，catH基因编码acyl-CoA transferases，opa22基因编码一种外膜蛋白，lpsH基因编码一种转膜蛋白，dmtH基因编码一种去甲基萘醌转移酶。这些基因都与类菌体分化、固氮调控、根瘤衰败相关。如dmtH 基因突变影响类菌体正常分裂分化和膜结构形成，导致根瘤提前衰败和失去固氮能力。克隆和鉴定了华癸中生根瘤菌类菌体分化有关的bacA基因，研究结果表明bacA基因突变导致细菌细胞膜发生了不可逆改变，这种改变引起其对宿主细胞环境压力的敏感性增加，最终导致了共生固
