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1、拟南芥培养拟南芥培养【仪器设备】1 培养架和配套灯管（北京正泰公司）、空调、排风扇（可以先参观919拟南芥培养室）2三角瓶、培养皿、弯头镊子、天平、高压蒸汽灭菌锅（909室）和超净工作台（919室）基本常识，不再列举3塑料小花盆（6cm-10cm，方形或圆型）和相应规格的托盘（均放于拟南芥培养室，购于农科院南门大森林花卉市场）【材料和试剂】1拟南芥种子（新采的种子放在干燥的地方脱水1周以上才可使用）2MS母液（I-VI）（放于908室绿冰箱中层，一般是做组培的同学配的，取用请打声招呼）；琼脂（不是琼脂糖），放于919室外靠墙的组培柜中3次氯酸钠（供应科，种子消毒用）稀释五倍后使用；无菌水；灭菌
2、200ul和1ml的枪头、1.5ml和10ml的管子和牙签、9cm平板(里面存放相应大小滤纸)4微酸性花卉营养土和蛭石（堆于909室门口，购买请找卢瑞弟，13701236937）【注意事项】1检查上面提到的东西是否都有，检查培养室中是否有空地2检查培养室中温度（18-24）、光照（灯光大盆顶光强大约维持在8000LUX左右）、通风（大的排气扇工作正常，人长时间待着不感觉闷）3种子可以直接播种于土壤或者先播种于MS培养基上，1周后移栽到土壤中，建议用后面的方式（苗子会长得强壮一些）。4苗子在生长过程中有蚜虫和小咬的危害，可以用镊子捉或者喷施蚜虫药（“护花神”，大自然花卉市场）。516/8h的光周
3、期条件下，拟南芥在生长20-25d间抽花葶，30d-35d时花葶长度约为3-8cm此时可以做转化用（步骤见后章），或者继续生长在50-60d时采收种子【操作步骤】（步骤2-5在超净工作台中操作）1配制MS平板平板培养基（详见杨英杰protocol组织培养“培养基配置”章）2在1.5ml或10ml管中，用次氯酸钠浸泡种子（先放种子、后放次氯酸钠，种子与次氯酸钠比例无所谓，次氯酸钠能完全浸泡种子就行），轻微晃动使完全接触，10min左右3用枪头吸弃次氯酸钠溶液4加入无菌水漂洗种子，然后用枪头吸弃无菌水5重复步骤4，5次6将种子倒在滤纸（用无菌水略湿润）上，再用牙签挑取播种于培养基上（滤纸不要太干或
4、太湿，以便挑取种子）7平板封好后放置于4冰箱中3d（春化）8取出平板放置于培养架上，约7d左右长出真叶，在第1对真叶长出后到第2对真叶萌发前移栽最合适（第7-10d）9蛭石和营养土1：1混匀，分装于小盆中，再浸足水分（自来水）10用弯头镊子轻轻钩住培养基上的幼苗最底部叶片，提起后轻轻夹住幼苗的根部，塞进土壤中，再盖上保鲜膜11苗子生长3天后，揭去保鲜膜。小盆（6-7cm）大约5天覆水1次，大盆（8-10cm）大约10天覆水1次，以土面微干为准拟南芥转化拟南芥转化拟南芥转化【仪器设备】1天平、高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、摇床（28）、分光光度计、低温离心机 2三角瓶、封口膜3塑料桶、黑布【材料和
5、试剂】1携带目的质粒的农杆菌2YEB培养基3牙签或枪头4侵染液：5%蔗糖，0.5 L-77，双蒸水配制。蔗糖放在组培柜中，L-77放在绿冰箱中层5正在花期的野生型拟南芥（30-35d大，花葶长度2-10cm均可，以5cm左右为宜）【注意事项】1检查上面提到的东西是否都有2农杆菌摇菌速度较慢，需要耗时24-48h，最好头一天早上开始摇菌【操作步骤】1摇菌，在超净台中用牙签挑取农杆菌放入YEB液体培养基中（100ml），封口后放入28摇床228，200rpm 摇菌24-48h，到OD600在1.0-2.0之间35000rpm 离心15min，弃去上清，收集沉淀，沉淀用侵染液悬浮，稀释至OD6000
6、.84修去拟南芥花葶上已开放的花朵，仅保留刚露白的花骨朵；用喷水喷壶将塑料桶内壁喷湿（为侵染过程保持湿度）5将花葶头浸入侵染液（0.5cm），3-5秒后取出放入塑料桶中，盖上桶盖，桶外蒙上黑布（遮光），20h左右取出，保持在光线较暗的环境中过夜，再转到正常的生长环境中。6转化后约1个月，收集已干燥、开裂的果荚，放在干燥的环境2周以上，就可以播种，进行抗生素筛选（根据载体确定抗生素的种类和浓度）。7播种时，用200ul枪头（剪去枪头尖0.5cm）吸取灭菌后的种子（灭菌详见上章拟南芥的培养），均匀列播在平板培养基上（最好的情况是播成1-2粒种子/列（需要多次实践能做到，5粒左右也是可以接受的），列边缘间距0.3-0.5cm），播完后，平板封好放置于4冰箱中3d（春化）8取出平板放置于培养架上，10d后，挑选具有绿色真叶和长出子叶的小苗，准备移栽9蛭石和营养土1：1混匀，分装于小盆中，再浸足水分（自来水）10用弯头镊子轻轻钩住培养基上幼苗最底部叶片，提起后轻轻夹住幼苗的根部，塞进土壤中，再盖上保鲜膜11苗子生长3天后，揭去保鲜膜。小盆（6-7cm）大约5天覆水1次，大盆（8-10cm）大约10天覆水1次，以土面微干为准
