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1、第二部分 柠檬酸发酵实验 一、目的要求了解利用黑曲霉生产柠檬酸的原理与流程，掌握柠檬酸的发酵生产工艺与发酵分析方法。通过本实验能较熟练地掌握真菌发酵的接种、培养与发酵产物的分析测定等技术。二、基本原理黑曲霉产柠檬酸多，耐酸力强；pH1.61.7时尚能生长，且酸度大时产生葡萄糖酸、草酸等副产物较少，故进行柠檬酸发酵时，培养液以pH23为宜。用于柠檬酸生产的原料有淀粉、废糖蜜等；本实验以糖等为发酵原料，黑曲霉为产生菌。在一般发酵中，均产生多种酸，其中，低碳链的直链脂肪酸如甲酸、乙酸等称为挥发酸，而乳酸、柠檬酸等称为非挥发酸。挥发酸和非挥发酸的总和称总酸。酸的测定方法常采用中和法、电位滴定法及比色法
2、等；若待测液色泽很深，可采用外指示剂法。本试验用中和法测定柠檬酸发酵中的总酸；柠檬酸的定性检验用Deniges试剂。三、实验材料1菌种 黑曲霉斜面菌种。2实验器材0.1molL标准NaOH； 0.1molL H2S04；展开剂：正丁醇：甲酸：水=40：55：5； Deniges试剂(HgO 1g溶于20ml 0.2LL H2S04中)；酒精灯；滤纸，漏斗；烧杯：200ml，500ml；18X180试管；吸管10ml、5ml，150ml三角瓶；碱滴定管，铁台、蝴蝶夹：酚酞指示剂：200ml量筒；广范pH试纸；pH酸度计；玻璃棒；布氏漏斗，抽滤纸，抽滤水泵，离心机和离心管，滴管，天平。层析缸（ 1
3、0cm15cm）、毛细管( 0.5mm)、玻棒、喷雾器、烘箱、尺、铅笔、干燥器，等。柠檬酸发酵培养基：硝酸铵2.0g，KH2P04 1.0g，MgS04 0.25g，蔗糖150g，水1000ml；pH控制在5.56.5左右，加1molL NaOH约2滴。取100ml上述培养液，加入500ml或300ml三角瓶中，包扎灭菌，待用。四、实验步骤（实验内容）预备实验：斜面培养基制备：可用PDA培养基或其它霉菌培养基，用于霉菌的培养。发酵培养基的制备：参见实验器材中的柠檬酸发酵培养基及其制作方法。1菌种活化与种子的制备菌种活化：对于已长久保存的菌种，需经斜面培养基活化培养一次，即取保存的斜面菌种黑曲霉
4、，移至斜面培养基，经2528斜面培养至孢子长好，作为活化后的种子（由实验员准备）。发酵用的种子制备：用同样方法，移接斜面培养基，得到的培养物作为发酵用的种子。2接种与发酵 取柠檬酸发酵培养基（液）3瓶，用接种环向每瓶接入黑曲霉孢子23环，2628摇床培养57d，摇床转速120150rpm，另1瓶不接种留作对照。注意：观察细胞生长情况及变化并记录；观察发酵过程中pH的变化并记录。当pH3左右是积累柠檬酸的最佳时期。3发酵液预处理取发酵液经过滤 将3瓶培养液一并过滤，菌丝用蒸馏水略加洗涤后弃去。4.发酵产物的检验与分析定性检验（略）： 取过滤液和对照液各约5ml，放入试管内，加Deniges液lm
5、l，在酒精灯上缓缓加热至沸。逐滴加入20gL KMn04溶液，若有柠檬酸存在，则出现白色沉淀。纸层析法：展开剂：正丁醇：甲酸：水=40：55：5（V/V/V）；显色剂：0.25g的甲基红和0.25g的溴酚蓝溶于100mL 70%的乙醇中，再用0.1mol/L的NaOH调成蓝绿色。层析纸：新华层析纸5号，裁成14cm23cm，裁剪时，纤维长丝方向与窄边平行，与长边垂直。方法：将展开剂配好后在钟罩内平衡3小时，在层析纸上距底边处用铅笔划一条直线（约距离层析液面1cm），每隔2.53cm铅笔轻点一下作一记号，并点上标样与试验样，置于层析缸中展开至展层溶剂到达距薄析顶端约1cm处时取出，用电吹风吹干，
6、喷上显色剂，有机酸在蓝紫色背景下显示黄色斑点。计算Rf值。 （此方法在室温下需要34h，可方便地检出发酵液中柠檬酸的纯度。）5柠檬酸含量的初步测定酸度滴定法： 将过滤液充分摇匀，用吸管吸取10ml放入150ml三角瓶中，加2滴酚酞指示剂，用0.1molL NaOH滴定酸度。对照亦按同法滴定。二者消耗NaOH毫升数的差额乘以0.64，即得柠檬酸(gL)的大约数。粗略法：pH值变化的测定五、实验结果与与讨论1、记录发酵过程细胞生长变化的现象；2、记录发酵过程产酸变化情况并进行结果分析(pH变化曲线)；3、柠檬酸定性、定量测定结果与分析，并对菌种产酸能力等进行评定。完成实验报告附 培养基：1） 查（
7、察）氏培养基：成分：NaNO3 2g，K2HPO4 1g，MgSO4. 7H2O 0.5g，KCL 0.5g，FeSO4.7H2O 0.01g，蔗糖30g，琼脂1520g，蒸馏水1000mL，pH值自然。制法：加热溶解，分装后121灭菌20min。2）马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：取约43g，加水至1000mL；121灭菌20min。3）发酵培养基：见实验器材柠檬酸含量测定 在一定量柠檬酸溶液中加入适量的去离子水，加入2-3滴酚酞指示剂，然后以0.1molL NaOH标准溶液滴定，记下体积v，柠檬酸总量按下式计算。 式中 vl0.1molL NaOH标准溶液体积(m1) c1NaOH标准溶液浓度(molL) v2所取柠檬酸样品体积(m1) Vo柠檬酸溶液总体积(L)
