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1、Transwell 侵袭实验总结之五兆芳芳创作第一节 概念这里想明确两个概念，一个是 Transwell，另一个是肿瘤 细胞侵袭模型 .关于 Transwell 这个词该如何解释，查了良多资料也未见 准确的注解，我觉得可以这么理解吧，trans 这个词根有转 移、转运、穿过等意思，well 有小室的意思，可以从字面上 理解，这是一类有通透性的杯状的装置，按照 Corning 公司 的 Transwell 说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器 （Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架 （permeable supports）.更准确地说， Transwell 应该是一
2、种实验技巧，这项技巧 的主要资料是 Transwell 小室（Transwell chamber， Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯 子，不合厂家对 Transwell 会有不合的命名，而不合型号也 可有不合形状，不合大小，按照实验需要，可有不合选择 .但无论是何种外形，其关头部分都是一致的，那就是杯 子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的资料与普 通的孔板是一样.这层膜带有微孔，孔径大小有 0.1 12.0m，按照不合需要可用不合资料，一般经常使用的是聚碳酸酯膜（ polycarbonate membrane ）.下图是一个 Transwell 装置的
3、纵切面将 Transwell 小室放入培养板中，小室内称上室，培养板 内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养 液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔 .我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下 层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研 究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响 .应用不合孔径和经过不合处理的聚碳酸酯膜，就可以进 行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的 研究.下面参考 guxuefeng 战友和 cosmosci 战友的帖子具体来 谈谈孔径的选择，当然不合细胞其体积不合，具体选择时 要考虑到细胞大小 .这里主要谈几种大家经常使用的实验：（1
4、）共培养体系：小于3.0um 孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若 研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜， 则应选择3.0m 以下孔径.经常使用0.4、3.0m.我们实验室 用的是0.4m.将细胞 A 种于上室，细胞 B 种于下室，可以研究细胞 B 排泄或代谢产生的物质对细胞 A 的影响.（2）趋化性实验可用5.0、8.0、12.0m 膜，上室细胞可穿过聚碳酸酯膜 进入下室，计数进入下室的细胞量可反应下室成分对上室 细胞的趋化能力.细胞 B 对细胞 A 的趋化作用：将细胞 A 种于上室，细 胞 B 种于下室，可以研究细胞 B 排泄或代谢产生的物质对 细胞 A 的趋化作用.趋化因子
5、对细胞的趋化作用：将细胞种于上室，下室 参加某种趋化因子，可研究该趋化因子对细胞的趋化作用 .（3）肿瘤细胞迁移实验经常使用 8.0、12.0m 膜，上室种肿瘤细胞，下室参加 FBS 或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的 下室跑，计数进入下室的细胞量可反应肿瘤细胞的迁移能 力.（4）肿瘤细胞侵袭实验经常使用 8.0、12.0m 膜，原理与肿瘤细胞迁移实验类似.上室种肿瘤细胞，下室参加 FBS 或某些特定的趋化因 子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑，但与肿瘤细胞迁 移实验不合的是，聚碳酸酯膜上室侧铺上一层基质胶，用 以模仿体内细胞外基质，细胞欲进入下室，先要排泄基质 金属蛋白酶（ MM
6、Ps）将基质胶降解，方可通过聚碳酸酯 膜.计数进入下室的细胞量可反应肿瘤细胞的侵袭能力 .用于研究肿瘤细胞侵袭能力的肿瘤细胞侵袭模型有如下 几种（引自司徒镇强细胞培养）：2.1 体内癌细胞侵袭模型2.1.1 皮下移植侵袭模型2.1.2 肌肉内移植侵袭模型2.1.3 腹腔内移植侵袭模型2.1.4 小鼠肾包膜下移植侵袭模型2.1.5 鼠睾丸包膜下移植侵袭模型2.1.6 小鼠耳廓皮下移植侵袭模型2.1.7 鼠爪垫皮下移植侵袭模型2.1.8 视网内界膜侵袭模型2.2 体外癌细胞侵袭模型2.2.1 体外静止器官培养法2.2.1.1 半固体培养基单细胞器官培养法2.2.1.2 液体培养基单细胞器官培养法2
7、.2.2 半体外半体内器官培养法2.2.3 单层细胞器官培养法2.2.4 瘤细胞球体器官培养法2.2.4.1 静止球体器官培养法2.2.4.2 旋转摇动球体器官培养法2.2.5 单层细胞侵袭实验模型2.2.6 Transwell 侵袭小室测定法可见，Transwell 与侵袭实验之间其实不克不及划等号， Transwell 有多种应用，侵袭实验也有多种办法 .所谓 Transwell 侵袭实验，其实是指将 Transwell 这一技巧应用于 肿瘤细胞侵袭研究的一种实验.由于其复杂易行、重复性好，因而得到了越来越普遍的应用，但不克不及认为研究 肿瘤侵袭只有 Transwell 一种办法.第二节
8、Transwell 侵袭实验我的课题涉及 Transwell 侵袭实验和 Transwell 迁移实 验，其他方面的 Transwell 应用我不太清楚，因此这里主要 谈谈 Transwell 侵袭实验.1.实验用品： Transwell 小室：多种厂家可提供，论坛里经常使用的是 Costar、 Corning、BD 生产的小室，我们实验室用的是 Chemicon 公 司的 ECM550系列，另有 Boyden chamber、Millipore 公司的 millicell 和雕弓满月射天狼战友介绍的 Thincert.这些厂家提供的小室，有的已铺好基质胶，买来就可以 用，很便利，但也比较贵，
9、我们实验室用的 Chemicon 公司 的 ECM550 系列是已经铺好胶的，质量很好，但是很是贵， 24孔板配套的小室，每个价钱约 130元，不推荐给大家 .BD 也有已包被好的，价钱不清楚.Coster 和 Corning 公司生产的 小室，是论坛里比较经常使用的，仿佛是要自己铺胶，但 据说每个小室成本只有 40左右，应该比较适合中国国情 .下面是一些战友提供的价钱，具体建议大家联系代理商 咨询.linanping1979 战友提供的价钱： coster 的24孔板的 transwell 的价钱是456元 RMB,8m，用于肿瘤的侵袭实 验.iceyxy 战友提供的价钱： Millipor
10、e 的8m 的50个 1760RMB,0.4m 的2000多,是一次性的.梅林战友提供的 BD 价钱： 240RMB 一块（6.5um,24孔,12instert），仿佛是没胶 的.liguofan 说国产的 boyden30块一个 .jjyy 提供的价钱是： corning cat No.3422. 6.5mm transwell with 8.0um prore polycarbonate membrane insert, Qty 48,950 人民币不到 .平均每 个20元不到.Transwell 小室依照公司的要求，都是一次性使用的 .不过 其实洗洗泡泡仍是可以重复用的 .我用的 Ch
11、emicon 公司的 ECM554，用完后擦去基质胶，再用胰酶和 75%酒精泡，可 以把膜洗得很洁净，用前用紫外里外都照 30min.sword01 战 友提供的处理办法：用棉签轻轻擦去胶和背面细胞，清水 冲洗，超声清洗，低挡，30min，清水35min，蒸馏水 35min，室温凉干，用前紫外线小室正面 3h，背面6h，微 波，低火10min2.因为我买的是铺好胶的，所以没买 Matrigel，二次利用 的小室只用来做不需要铺胶的迁移实验.以前的 Chemicon ECM550系列，膜很结实，擦不坏，可以频频用良多次，但现在的膜已经改用一种很薄很脆的资料，一般只能重复用 一次，真黑啊！良多战友
12、说 Costar 和 Corning 也是可以重复 用的，大家可以试试.自己没见过，有兴趣的可以自己研究一下 .另外，按照论坛战友提供的信息，osmonic 公司有专用的 膜出售，鼎国生物代理 .Transwell 小室用当时，可把原来的 膜切下，贴上 osmonic 公司的膜，这样又可以用了，不过我 没用过，有兴趣的可以试试 .maojianwen 战友的使用办法： trasnwell 小室做一次后，将原来的膜去掉，重新泡酸，泡酒 精，使用前照紫外，然后用女士用指甲油（注意用无色较 稀的）将 osmonic 公司的膜贴上，剪掉多余的边沿 .再照紫 外. 上层培养液：上层培养液采取无血清培养基
13、，为维持渗透压，需参加 0.05%0.2% BSA. 细胞：值得注意的是，有侵袭能力的细胞才可用于 Transwell 侵 袭实验.建议实验前先用酶谱法检测 MMPs 的表达，特别是 MMP2的表达 .如果不清楚细胞 MMPs 的表达情况，就盲目进行 Transwell 侵袭实验，可能会造成不需要的浪费，一次 Transwell 侵袭实验花钱少则数百，多则数千，其实不是笔 小数目，仍是小心为妙 .另外，为了让实验结果更明显，可先撤血清让细胞饥饿 1224h，再进行实验 . 基质胶：经常使用的是人工重构基底膜资料 Matrigel，主要成分 为层黏连蛋白和型胶原，生产厂家有 BD、美国 Coll
14、aborative Rsearch 公司等.CaoY 战友的帖这么说的： Matrigel 是 BD 公司生产的，是一种细胞外基质， 4度时是 液体，在37度会逐渐凝固成胶状，不成逆 .同样的东西在 sigma 叫 ECM.zhangyong1036 战友提供的价钱： BD 公司的 matrigel 1500 左右.如果采办的小室是已经铺好基质胶的，那么 Matrigel 就 不需要采办了 . 下层培养液：下层经常使用含5%10% FBS 的培养基，具体浓度按照 细胞侵袭力而定，侵袭力弱的细胞可适当提高 FBS 浓度.下 层也可用趋化因子，有战友将纤维粘连蛋白参加下层培养液作为趋化因子，但团体
15、认为， FBS 仍是最适合的. 细胞培养板：经常使用于 Transwell 侵袭实验的细胞培养板有6孔板、 12孔板、24孔板等，以24孔最经常使用.细胞培养板没什么 特殊要求，普通的细胞培养板就可以 .但要注意，细胞培养 板应当与采办的 Transwell 小室相配套 . 此外，膜的下室面可涂上纤维粘连蛋白 (fibronectin ， FN，Sigma 有售)，这样做的目的是使穿过膜的细胞更好地 附着在膜上，也可用胶原（ collagen）或明胶（gelatin）.良 多战友认为这不是必须的，并且我也是不涂的，细胞照样 贴壁很好.如果贴壁欠好的话可以试试看 .linanping1979 战友 认为，如果培养时间很长（ 24h），细胞仍是会掉到下室 里面去，所以有条件的话，最好仍是在膜下层涂上 FN.另外，值得一提的是，膜下层涂上 FN 还有一定的趋化 作用.2步调2.1 Transwell 小室制备2.1.1 无基质胶 Trans
