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1、抽提出高质量的RNA。要求：实验器材和用品做好抑制RNA酶准备；操作过程中避免RNA酶污染；提取的组织细胞样品不能太多（可能裂解不充分等）。2、选用高质量的RT酶。如Promega、Invitrogen公司等。3、引物设计正确。尤其注意动物种属、至少包含1个内含子、参考文献的质量等。4、PCR扩增中循环次数恰当。过少的循环次数条带出不来，过高的循环次数条带太亮看不出差异（达到平台期后也不准确）。5、Mg2+浓度和Taq酶含量适度。过高容易引起非特异性条带。6、建议在RT逆转录前可以对样品进行DNA酶处理，以纯化提取的样品RNA。7、图像定量分析时尽量选择浅条带，太亮的条带不可靠。我在做半定量Rt-Pcr如下图。跑出来发现平行样的亮度差异颇大。实验设计：共有个的样本分别命名为，检测其中某基因表达的差异。为了准确每个样本设3个平行样，也就是说A1,A2,A3均是从同一管管取等量的（），加入同样的反应系统（先配好反应系统再分装到各管中），用同一次反应跑出来的。发现平行样的亮度差异颇大。尤其是和系列，几乎相差两倍。请问各位大侠，PCR中平行样的误差真有这么大吗？还是我的操作有问题？请各位大侠帮忙.我用的是50ul的反映系统，条件是：94C30秒，55C60秒,72C60秒。25次循环0
