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1、碱性大孔离子交换树脂分离熊去氧胆酸目录1前言11.1 研究意义11.2 离子交换树脂分离技术的原理及应用42离子交换法精制熊去氧胆酸92.1 实验材料和仪器92.2 实验方法与步骤103 实验结果和讨论133.1 熊去氧胆酸的HPLC检测133.2 吸附交换过程热力学研究143.3 吸附交换过程动力学研究183.4 静态条件下不同洗脱剂的选定193.5 柱操作条件研究203.6 离子交换柱分离熊去氧胆酸214 产物的鉴定和表征244.1 材料与方法244.2 结果与讨论255 总结与展望31参考文献32致谢34摘要熊去氧胆酸（Ursodeoxycholic Acid，UDCA）是FDA惟一批准
2、可用于治疗原发性胆汁性肝硬化的有效药物。在化学合成工艺中，常利用牛羊胆汁中提取出的UDCA差向异构体鹅去氧胆酸（Chenodeoxycholic Acid，CDCA），由氧化还原法合成UDCA，但中间产物及杂质较多使终产品纯度不高。本课题的研究方向是采用碱性大孔阴离子交换树脂D201型树脂对UDCA进行纯化，笔者主要从动、静两方面考察树脂对熊去氧胆酸的分离条件。结果表明，UDCA能良好地吸附在D201树脂上，等温吸附曲线拟合符合Langmiur经验式，在298 318K的条件下，每克树脂的静态实验吸附量为2035 mg，动态实验吸附量为4050mg。在298K条件下，进行柱层析分离，并且通过多
3、种方法对终产物进行表征，由分步洗脱得到的UDCA的精制产品纯度可达90%以上。关键词：熊去氧胆酸，离子交换树脂，高效液相色谱AbstractUrsodeoxycholic Acid (UDCA) is the only approved drug for the treatment of primary biliary cirrhosis by FDA. In chemical synthesis process, Chenodeoxycholic Acid(CDCA)，epimer of UDCA, extracted from cattle and sheeps bile, is ofte
4、n used for the synthesis of UDCA through oxidation reduction. Yet, a quantity of intermediate products and impurities will lead to the low purity of the final product.The research direction of this paper is to purify the UDCA by basic macroporous anion exchange resin D201, and the researcher mainly
5、study about the separation conditions of ursodeoxycholic acid resin from static and dynamic aspects. The results show that UDCA can be well adsorbed on the D201 resin. Whats more, the adsorption isotherm curve can nearly fit with Langmiur experience. At 298 318K, under the condition of static experi
6、ments, the adsorption capacity per gram of resin can reach 20 35 mg, while under the dynamic experiments,the adsorption capacity can reach 40 50mg. At 298K, separated by column chromatography through stepwise elution and characterized by a variety of methods, finally, the refined product UDCA can re
7、ach a purity of more than 90%.Keywords: Ursodeoxycholic acid, ion exchange resin, HPLCI碱性大孔离子交换树脂分离熊去氧胆酸1 前言1.1 研究意义在珍贵的中医药材中，熊去氧胆酸（Ursodeoxycholic Acid，UDCA）是熊胆的特有成分，它是一种3,7-二羟基-5-胆甾烷-24-酸。在临床医学上，各种胆囊及胃肠道疾病运用该药材均可以获得很好的疗效。在我国以及东南亚地区，人们已经开始广泛地开发并且有效利用该种药材的中药制剂。我国通常采用的制备方法是较为原始的传统工艺，然而随着野生动物越发稀有，并且有关
8、动物保护的法规变得日趋严格，化学合成法的普及迫在眉睫。根据现有资料已经有所报道的制备熊去氧胆酸的方法是从牛、羊的胆汁中提取、分离出牛胆酸，经过多步反应合成得到UDCA的差向异构体鹅去氧胆酸（Chenodeoxycholic Acid，CDCA），由于二者仅仅在7位羟基构型上有所差异，再经过若干步氧化还原反应，最终就能实现将CDCA转化成为UDCA，然而此法所采用的合成路线、工艺极为复杂，并且产品中往往含有大量的中间产物以及杂质，导致最终所得到的产品纯度不高1。当今世界，欧美厂商是UDCA的生产主力军，对UDCA的主要市场需求为日韩、欧美发达国家，就这一良好的形势而言，胆酸类药物出口的前景十分乐
9、观。现代有机合成工业发展迅速，离子交换技术发展突飞猛进。随着多种性能优良的离子交换树脂的研制成功，多种新应用方法的开发也日趋丰富起来，在诸多行业特别是高新技术产业以及科研领域中，该法均得到了广泛地应用。由于该法高效而又安全，笔者将其应用于分离纯化UDCA的研究中。在工业化规模生产中，由于离子交换树脂的具备处理能力大、脱色范围广、脱色容量高的优点，并且能够去除各种不同离子，还能反复再生使用、工作寿命也长、运行费用较低，其他方法无法与之相媲美，在工业化生产中具有其他材料无法匹敌的潜在优势。本课题的研究方向即采用碱性大孔阴离子交换树脂D201型树脂对UDCA进行纯化，笔者主要从动、静两方面考察树脂对
10、其吸附的热动力学性质。在298K条件下，进行柱层析分离，并且通过多种方法对终产物进行表征，由分步洗脱得到的UDCA的精制产品纯度可达90% 以上，使得合成工艺大大简化，有效地提高了产率，由于可以直接在常温下进行，降低了成本，有望实现工业化推广。1.1.1 熊去氧胆酸简介熊去氧胆酸是高等动物胆汁中最常见的胆汁酸之一，是一种亲水胆酸，其主要成分为3,7-二羟基-5-胆甾烷-24-酸，属于有机化合物。就其物化性质而言，UDCA无臭，味苦，易溶于乙醇与冰醋酸，在氢氧化钠试液中也能够溶解，但无法在氯仿中溶解。表1.1熊去氧胆酸的物化性质熊去氧胆酸化学式C24H40O4分子量392.58色泽白色粉末气味无
11、臭、味苦熔点介于2002040C之间比旋度介于+59.0+62.0之间（40 mg / ml 无水乙醇溶液测定）pKa5溶解性几乎不溶于水，易溶于乙醇、冰醋酸等，不溶于氯仿，能溶于碱性溶液敏感性对光、氧、高温及湿度等相对不是很敏感人类胆汁的主要成分是胆汁酸（简称为胆酸），其首先由肝脏合成，并经胆囊或者是小肠分泌，主要是以与牛磺酸、甘氨酸共轭的形式存在。在小肠中，初级胆汁酸、胆酸（Cholic Acid，CA）和鹅去氧胆酸，可能是由肠道细菌脱去结合形式，形成次级胆汁酸，如脱氧胆酸（Deoxycholic Acid，DCA）、石胆酸（Lithocholic Acid，LCA）和熊去氧胆酸，它们都是
12、胆烷酸的衍生物，都含有24个碳原子。随后，为了摄取和重新分泌进入胆汁，胆汁酸经由门静脉系统，能有效地被重新吸收并运输回肝脏（即胆汁酸的肠肝循环）。在肠道的胆汁酸肠肝循环过程中，肠道胆汁酸的一小部分随粪便排出，并被肝脏从头合成所取代。胆酸是胆汁的重要组分，在脂类物质消化吸收及调节胆固醇代谢方面，胆酸都起到了十分重要的作用。在正常人类的胆汁中，UDCA占人体总胆酸的3%，它能够松弛胆总管括约肌，促进肝脏糖原蓄积，有保肝解毒的功效，是名贵中药熊胆所蕴含的主要有效成分，在临床医学上，对于各种胆疾以及消化道疾病方面都具有良好的疗效2。图1-1 熊去氧胆酸的结构图1-2 游离型胆汁酸和结合型胆汁酸熊去氧胆
13、酸最早是由日本冈山大学的Shoda从中国熊的胆汁中分离从而获名。通常情况下，在正常人体中，只有少量的胆汁酸会存在于周边血液及尿液中。然而，在肝胆、肠道疾病中，合成、代谢紊乱，以及由肝脏和小肠吸收的清洁等特殊因素，会影响在不同池室（如血清、肝脏、胆囊、尿液、粪便）中胆汁酸的分布浓度3。1985年时，Leuschner等人用UDCA治疗合并肝炎的胆结石时发现血清转氨酶降低，在此之后，大量的临床医学研究也证实了UDCA对治疗一些肝病确实有着显著的效果。UDCA在治疗肝病方面的作用机制以及疗效如下：胆汁淤积性肝病与鹅去氧胆酸、去氧胆酸和石胆酸的积聚有关，由于去垢作用，这些胆酸会损害肝细胞，而UDCA却
14、是一种没有毒性的亲水胆酸，能竞争性地抑制回肠吸收具有毒性的内源性胆酸。通过激活钙离子、蛋白激酶C组成的信号网络，并激活分裂活性蛋白激酶，可以提高胆汁淤积肝细胞的分泌能力，同时降低血液以及肝细胞中的内源性疏水胆酸浓度，从而起到抗胆汁淤积的效果。UDCA还能竞争性地取代细胞膜和细胞器上的毒性胆酸分子，防止更多的毒性胆酸损害肝细胞和胆管细胞4-6。以上作用具体表现在：细胞保护作用。UDCA结合物能明显减轻疏水胆酸诱发的肝细胞的细胞溶解，减少培养鼠和人类肝细胞由毒性胆酸诱发的细胞凋亡。膜稳定作用。UDCA可防止胆酸诱发的线粒体膜渗透性改变，也就是说可通过膜稳定作用来防止毒性胆酸诱发的腺粒体膜、基底膜和
15、小胆管膜损害。抗氧化作用。UDCA能抑制毒性胆酸引起的枯否细胞激活，还能增加肝细胞谷胱甘肽和含硫醇蛋白的水平，防止肝细胞的氧化损伤。免疫调节作用。UDCA通过降低疏水胆酸的刺激作用间接抑制，并通过激活糖皮质激素受体直接抑制组织相容性复合体（MHC）类和类基因的表达5。1.2 离子交换树脂分离技术的原理及应用在离子交换分离的操作中，其物质基础是离子交换剂，树脂自身性能的优劣决定了分离效果的优良。在使用过程中，离子交换树脂应当具备满足工艺上所需要的足够交换能力、选择性以及交换速度。由于离子交换树脂品种良多，而且其各自的化学组成和结构也不尽相同，从而在功能以及特性上显现出不同，可以分别应用于不同的分离用途中。树脂的交换容量称为交换能力，根据一定的生产规模，可以决定使用的树脂量。选择性用以度量树脂的分离能力，它反映了树脂对不同离子的亲和力。树脂工程性能的重要指标之一是交换速度，它能体现出树脂的动力学性能4。在使用树脂的过程中，它与水溶液构成了固液非均相传质体系。因此，离子交换树脂必须具备适宜的微观结构，即一定的孔隙率、孔径以及比表面积，此外对密度、粒度以及强度也有一定的要求。1.2.1 原理大孔树脂包含大孔离子交换树脂及大孔吸附树脂，通常情况下，
