小鼠骨髓细胞染色体标本的制备和观察生14 孙晓川 2011011983一、 实验目的了解利用动物骨髓进行细胞染色体制片的一般方法，比较与其他制片方法的区别正确掌握细胞收集、低渗、滴片等技术手段，观察和了解小鼠染色体的数目及形态特征二、 实验原理染色体的数目及形态特征在一个物种内是相对稳定的，染色体上的基因决定了一个物种生长发育的全部信息因此通过染色体分析，可以了解某一物种最基本的遗传指标而制备优良的细胞学标本是进一步开展染色体分带、组型分析和原位杂交的前提进行染色体标本的制备一般取自细胞分裂旺盛的组织，如骨髓、淋巴细胞以及通过人工培养的悬浮液动物的骨髓是重要的造血器官，它通过细胞分裂不断补充体内的需要，如将秋水仙素注射到动物的腹腔内，可使正在分裂的骨髓细胞不能形成纺锤体，使得染色体停留在中期状态，经过处理和制片后就可以清楚地观察到染色体这种方法省去了细胞培养的阶段，可以获得大量的分裂细胞，效果很好，但是属于侵害性的，因此只适用于动物来源丰富、动物个体较小的材料对于大型动物可以采取骨髓穿刺术获得红骨髓，在临床上用于一些血液疾病的研究分析对于一些珍贵的鸟类，可采用羽髓来制片人类的染色体分析可采用外周血培养的方法来获得大量的细胞材料。
三、 实验用具及材料解剖刀、解剖盘、剪、注射器、离心机、显微镜、烧杯、体重在20g左右的小鼠、低渗液（0.075MKCl）、固定液（甲醇与醋酸二者体积比为3:1）、4.0g/L秋水仙素溶液、改良苯酚品红溶液四、 实验方法及步骤1. 腹腔注射秋水仙素溶液，处理2~3h，也可时间更长或过夜助教已完成）2. 取材：用断颈法迅速将小鼠处死解剖后将股骨取出，用刀片将附在其上的肉剥离干净，然后用纱布擦净用解剖剪将股骨头剪开，暴露出骨髓腔用注射器吸取在37℃下保温的低渗液2mL，将针头插入骨髓腔中冲洗骨髓，使冲洗液沿股骨的另一端流出收集冲洗液到5mL刻度离心管内，最终使冲洗液达到4mL3. 低渗：用吸管将冲洗液吹打几次，然后把离心管放在37℃的恒温水浴锅中低渗25min4. 固定：低渗结束后将离心管取出，加入1mL固定液，用吸管吹打均匀后放到37℃下固定10min5. 离心：将离心管配平后，放到离心机的对称位置上，1500r/min离心10min6. 再固定：离心结束后，弃掉离心管中的上清液，加入新配制的固定液1mL，用吸管吹打均匀后在37℃下再固定10min7. 离心：配平离心管后，在1500r/min转速的条件下离心10min。
8. 制备细胞悬液：离心结束后，弃去上清液（避免将沉淀悬起），最后留大约与沉淀等量的上清液，用吸管吹打成细胞悬液9. 滴片：从冰盒内取出预冷的载玻片，在地上将4张载玻片并排摆在一起将细胞悬液吸入吸管内，手持吸管在载玻片上方尽量高的位置向下滴片10. 干燥：在室温下自然晾干11. 染色：直接将染色液滴加在载玻片上有细胞悬液痕迹的位置上染色12min12. 去浮色：用清水将染料轻轻冲去，自然晾干13. 镜检：先用低倍镜找到一个较好的分裂相区域，然后转用高倍镜进行详细的观察，并在油镜下照相五、 实验结果 图1 小鼠骨髓细胞染色体六、 结果分析1. 由于操作失误，照片上没有标尺，因此只得从减数分裂那次实验的照片上，将标尺部分裁剪下来，粘在了图片的右下角，以便确定显微图像中的染色体及细胞大小2. 在图片中央，有一个较明显的分裂中期的小鼠骨髓细胞染色体图样观察发现，小鼠染色体有的呈“U”字形（如图中箭头所指），更多的呈纺锤形，但并没有出现“X”形查阅资料得知：小鼠染色体形态全部为近端着丝粒染色体所以理论上，图片中的染色体应该均为“U”型，然而在制片过程中，染色体的形态难免会出现一些变化，原本的姐妹染色单体可能会被“压开”，从而由典型的“U”，变成了纺锤状。
但毕竟没有出现“X”形的染色体，因此我觉得实验结果还是与理论相吻合的3. 由图中的染色体图样，统计小鼠的染色体数目，发现2n=39然而，显然双倍体的染色体数目应该为偶数查阅资料得知，小鼠的染色体数目为40我觉得计数与理论存在差异，主要是由压片并未完全压开，染色体之间存在重叠和交叉造成的不过，差异并不大，因此我觉得装片的制作还是比较令人满意的4. 如果要给自己的这张照片打分，我觉得应该在90左右需要改进的方面有以下几点：1） 应该加上标尺2） 焦距有可能在调的准确些，图片中的染色体边缘还是有些模糊七、 总结讨论这次实验过程中出现了很多bug开始处死小鼠时，我本想用一个“寸劲”，让它少受些痛苦但是由于没有经验，拉扯了很久才慢慢将其处死，感觉还是有些愧疚之后，队友将一段股骨掰断，而我也是在染色前忘记了干燥，直接导致两张装片观察不到典型的分裂中期的染色体形态但幸好最后在仅存的一张装片上，观察得到较好的染色体图样，因此实验还不至于失败重做我觉得出现这些问题的主要原因是我们过分追求速度，想尽早完成实验然而，最后bug不断，我们也同样拖到了6点左右可见，欲速则不达，以后做实验还是应该首先保证操作的正确。
另外，这次实验中还安排了显微照相的考试整体上，我觉得照出的效果还不错，但不知是什么原因，虽然我在照之前，点了scale和M4，但最后的图像上还是没有标尺除此之外，完成照相操作后，我急于把装片交给同组的同学，结果忘记了将显微镜复位（物镜调到4倍镜，载物台降至最低，孔径光阑调到最小等），下次应该注意八、 参考文献《普通遗传学实验指导》 张贵友等编著 清华大学出版社九、 思考题1. 低渗液起到什么作用，在使用过程中应注意什么问题？答：1）低渗液可使细胞吸水膨胀，更易破裂，从而利于染色体的分散2）低渗液在使用前应进行预热处理，以免温度变化过大，影响低渗效果另外，低渗处理的时间应该严格控制如果时间过长，会使细胞中的染色体大量流失而变得较少；如果时间过短，则细胞破裂不充分，染色体很难分散开，从而影响到之后的观察和计数。