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1、 长春工业大学学士学位论文 摘 要 中国林蛙（Rana chensinensis David）又名蛤什蟆，属两栖纲、无尾目、蛙科、蛙属，是集药用、食补、美容功能于一体的珍稀两栖类动物，具有很高的应用价值和开发潜力。 本文以东北林蛙皮为实验材料，以多糖的提取率为考察指标，将林蛙皮粉碎，过筛，活性炭脱腥，比较热水提取法、碱提取法、酶提取法三种不同提取方法的提取效果，并用苯酚-硫酸法测定多糖含量。实验结果表明，酶法提取效果最佳，其次是热水提取法和碱提取法。采用正交试验法对酶法提取多糖的工艺进行优化，得出其最佳提取工艺条件为：酶用量2%，胃蛋白酶与胰蛋白酶比2:1，提取温度50，提取时间7h，多糖提取
2、率为0.91%。关键词：林蛙皮；多糖；酶法；正交试验1Abstract Chinese forest frog ( Rana chensinensis David ) aka Hashima, belonging to the Amphibia,Anura, frog, Rana, is a set of medical, food, cosmetic functions in one of the rare amphibian animal, has very high value for application and promising future. The skin of Rana
3、dybowskii is used as experimental material, with the extraction rate of polysaccharide as an index. Crushing the forest frog skin , sieving it, activated carbon deodorization, compared with hot water extraction, alkali extraction, enzyme extraction of three different extraction methods, and by pheno
4、l sulfuric acid method for the determination of polysaccharide content. The experimental shows that enzymatic extraction has the best effect, , followed by hot water extraction and alkali extraction. Using the orthogonal test method on enzyme extraction polysaccharide technology optimization, the op
5、timum extraction conditions for enzyme dosage:2% enzyme, pepsin and trypsin than 2:1, extraction temperature is 50 , extraction time is 7h, polysaccharides extraction rate is 0.91%.Key words: forest frog skin; polysaccharide; enzyme method; orthogonal test 目 录摘 要1Abstract1目 录2第一章 前 言4第二章 文献综述52.1 中国
6、林蛙52.1.1 中国林蛙的特征52.1.2 林蛙的功能作用62.1.3 林蛙的国内外研究现状72.2林蛙皮72.2.1林蛙皮的功能72.2.2 林蛙皮研究现状和应用前景102.3多糖112.3.1 多糖的概念112.3.2多糖的结构122.3.3 多糖的功效122.3.4 多糖的分离提纯方法概述12第三章 实验部分143.1材料与设备143.1.1原材料143.1.2主要仪器143.1.3主要试剂143.2蛙皮多糖含量的测定153.2.1 苯酚-硫酸法测定蛙皮多糖的含量153.2.2 多糖提取率的计算153.3 林蛙皮多糖提取方法的比较153.3.1 热回流法提取蛙皮多糖153.3.2 酶法
7、提取蛙皮多糖163.3.3 碱法183.4 正交实验法优化蛙皮多糖的提取工艺193.5 结果与讨论203.5.1葡萄糖标准曲线的绘制203.5.2单因素实验结果分析213.5.3 正交试验优化蛙皮多糖提取工艺结果分析25第四章 结论与展望284.1 结论284.2 展望28致 谢29参考文献30第一章 前 言中国林蛙( Rana chensinensis David) 又名蛤什蟆。属两栖纲、无尾目、蛙科、蛙属1，主产东北, 属国家保护的有益的或者有重要经济、科学研究价值的陆生野生动物中经济价值很高的两栖动物2，世界自然保护联盟( IUCN) 列其为易危物种3 。林蛙营养价值较高，俗称“大补品”
8、 由于其以昆虫类为食物亦称“农林卫士”和“纯绿色食品”，因此在近几年的市场上显现出巨大的商机。由于其具有极高的药用和保键价值并且含有纯正绿色野味的食用价值逐渐被人们认识和利用开发，导致东北林蛙地区的人们无限制的灭绝式捕杀这一类野生动物，使这一珍稀的野生资源逐年减少，产需失衡，日趋枯竭，成为濒危物种。随着工农业生产和城市建设的不断发展，人们对土地、森林、草场的利用不尽合理，中国林蛙的适生环境遭到破坏，导致生态平衡失调，从而危及中国林蛙的生存和繁衍。建国初期，中国林蛙分布区的森林覆盖率为79.8%，1980年降为65.2%， 1987 年又降到58%4 。中国林蛙分布区内广泛使用化学除草剂、杀虫剂
9、、化学肥料等，以及山区、半山区的工厂、矿山长期排放大量的废水、废气、废渣, 使中国林蛙的生存环境变得十分恶劣，蝌蚪难以成活，繁殖受阻，活动空间变小。加上对野生资源的过度捕抓(利用)，目前约有60%70%的适生区域，中国林蛙分布密度剧烈下降，有的地区甚至很难找见。近年来中国林蛙的人工养殖在其主产地东北已初具规模, 并且正朝着产业化方向发展, 养殖中国林蛙的经济效益十分可观。开展中国林蛙资源状况调查, 对保护林蛙资源和促进中国林蛙养殖业的持续健康发展都具有重要意义5。林蛙全身是宝：其中林蛙皮是高级制革业的主要资源；林蛙卵富含卵磷脂和性激素；林蛙肉因其高蛋白6、低脂肪的特性可加工高级保健品；林蛙雌蛙
10、输卵管干燥物即哈士蟆油，是极其珍贵的药材。哈士蟆油是我国医学中的滋补强壮之药，有补虚、增精、退热、解毒、消肿、润肺、健脾胃、益肝肾之功， 可治疗失眠眩晕和神经衰弱、脾胃虚弱、咳嗽肺虚、体弱气虚、水肿腹胀、创痛肿毒、疮疾和肝炎、肺结核等疾病7 。目前国内外对林蛙的研究主要集中在胶原蛋白这一块，对林蛙多糖的研究较少，其实动物多糖在降血压，增强免疫，抗肿瘤这些方面有很好的疗效，些动物多糖具有排除肠道毒素和降低重金属对人体的毒害、抗辐射、防龋齿等方面的保健作用。另外，壳聚糖含有游离氨基显碱性，在胃里能中和胃酸，形成一层保护膜，可辅助治疗胃酸过多症和预防消化性胃溃疡；透明质酸具有保持皮肤弹性的功能，还能
11、保留大量水分子，对皮肤具有保湿作用8。本论文的研究内容主要包括两部分：第一部分是酶法，碱法9，热水浸提法10林蛙皮中多糖的方法叙述；第二部分优化比较最佳工艺。第二章 文献综述2.1 中国林蛙2.1.1 中国林蛙的特征中国林蛙俗称“哈士蟆”或“哈什蟆”、黄蛤蟆或油蛤蟆，医药界又称“田鸡”。在动物学分类上，属于脊索动物门，脊椎动物亚门，两栖纲，无尾目，蛙科，林蛙属，是中国著名的集药。本草纲目记载：哈什蚂，本草纲目中称之“山哈”，别名哈什蚂、雪哈。中国林蛙，形状似蛤蟆，古时，女真人（满族）称之为哈什蚂，意为圣洁。民间传说哈什蚂以人参为食，吃灵芝草而冬眠，是一种能赐福、消灾的吉祥物 。现今被命名为中国
12、林蛙。主要产于我国东北的长白山区，是东北地区特有的蛙种中国东北林蛙是国家保护动物。自明代始，即为供品,被立为皇家食谱中“三宝”(哈什蚂、红景天、不老草)。清太祖努尔哈赤用中国林蛙祭祖,由此，中国林蛙成为清王朝宫廷贡品，被列为八珍之首（蚂、参、翅、骨、肚、窝、掌、筋），中华人民共和国建国后，中国林蛙被立为中国“四大山珍”（熊掌、林蛙、飞龙、猴头）。从中国林蛙皮中提取到的保湿因子，添加到化妆品中，可以起到极佳的保湿效果。从中国林蛙卵中提取到的低分子活性物质，可以用其生产美容产品，减缓人体皮肤衰老。蛙头、蛙皮、蛙肝脏等部位均是制造保健、美容食品的极佳原料11。提取到林蛙油后的副产品，如骨骼、内脏、肌
13、肉等也可作为毛皮动物的饲料，又可浸泡后入药。林蛙除了药用、美容、保健、饲料价值外，在中国东三省和广东、台湾及东南亚等地又被人们充分的认可，具有纯天然的绿色的药用和食用价值，因而，具有广泛的消费市场。 中国林蛙雌蛙体长约为7190mm，雄蛙较小；头长宽相等或略宽，头较扁平；吻棱较明显，吻端钝圆，略突出于下颌；鼻间距大于眼间距而与上眼睑宽，鼻孔位于吻眼之间；鼓膜显著，且大于眼径的一半，位于内鼻孔内侧的犁骨齿两短斜行，前肢较为短壮，指端较圆，指细长，指长顺序为3、4、2、第1、3指几等长；指基下瘤、关节下瘤及内外掌突均较为显著。后肢长。胫跗关节前可达到眼或略超过，左右跟部则明显重叠，胫长超过体长的一
14、半，足与胫等长或者略长；趾端较钝圆；趾较细长，第3、5趾达第4趾的第2、3关节下瘤的中部，蹼发达，除第4趾以外，其余的各趾的蹼多少至趾端然而蹼缘缺刻较大，外侧的跖间有蹼而不发达；关节下瘤小而明显，内跖突窄而长，外跖突小而圆。皮肤上微小痣粒较多，口角后端的颌腺非常明显，背侧的褶在颞部不平直而且成曲折状，在鼓膜上方的侧褶略微斜向外侧，随即又折向中线处，再向后延伸达胯部；两侧的褶间有少数分散疣粒，在肩部则有排成“人”形者。腹面皮肤光滑。两眼间深色横纹及鼓膜处三角斑较清晰，背面与体侧有分散黑斑点，通常都在疣粒上；四肢的横斑清晰；腹面的灰色斑点颇多，有的甚至从咽至腹后都存在斑纹。雄蛙前肢较为粗壮，第1指
15、上灰色的婚垫极发达；有一对咽侧下内声囊。蛤士蟆1年的生活周期可分为水中生活和陆地生活两个明显不同的阶段。水中生活阶段是在较深的水域中进入冬眠状态，以渡过寒冷的冬季，一般从9月下旬到翌年4月中旬，历时150180天。此时的蛤士模多群集于水下穴洞之中，不食少，新陈代谢降到极低水平；陆地生活阶段是到春季冰雪溶化，水温变暖时，冬眠的蛤士蟆渐渐开始活动，随着水温和气温的升高陆续上岸。此时的雌雄蛙体生殖腺均已成熟，在温暖的浅水池沼、田水中“抱对”和产卵，排精，在水体外受精，形成受精卵。蛤十蟆完成生殖活动后，即进入陆地山林的草丛或灌丛中，营陆地生活。随着气温的升高，蛤士模逐渐由低地向高地，由阳坡向明坡迁移。此时援食旺盛，蛙体渐肥，幼蛙也正处于迅速生长时期，从9月中旬开始，气温降到15以下时，蛤土蟆开始向山下迁移，陆续到达越冬水域周围，在气温降到10以下时，即陆续进入水中，又从陆地生活转入水中生活。蛤士蟆蝌蚪在水中为鳃呼吸，以植物碎屑、藻类、植物嫩芽、嫩叶等为食，为植物性食性期，约30d左右。变成蛙后即离水登陆，转变成动物性食性，以昆虫，蜘蛛，蜗牛等活饵为食，因有特殊结构和功能的蛙舌，故有很
