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1、实验九 e.coli感受态细胞的制备和转化 实验目的1. 学习分子生物学的实验操作技术。 2. 掌握 e. coli感受态细胞的制备和转化的方法。实验原理 未经处理的受体菌细胞对受纳重组分子不敏感，难以实现转化。当用理化方法诱导细胞，使细胞处于最适摄取和容忍外来dna的生理状态一感受态后，才有较高的转化频率，这种细胞称为感受态细胞。 将重组dna转化受体菌，技术关键是通过化学方法诱导细菌进人感受态，以利于外源dna被导入。这项技术始于mandel和hiag1970年的观察。他们发现细菌经过冰冷氯化钙溶液处理及短暂热休克（hea shock）后，容易被dna感染；随后cohen于1972年进一步
2、证明质粒dna用同样方法也能进入细菌。其原理是：细菌处于0氯化钙低渗溶液中，细胞膨胀成球形。转化混合物中的dna形成抗dna酶的羟基鸟磷酸复合物粘附于细胞表面；经42短时间热休克处理，促进细胞吸收dna复合物。在丰富的培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。被转化的细菌中，重组的基因得到表达，在选择性培养基平板上可筛选出所需的转化因子。 除化学法转化细胞外，还有电击法。电击法不需要预先诱导细菌进人感受态，只依靠短暂的电击，促使dna进人细胞。因其操作简单方便、转化率高，愈来愈为人们接受。 实验用品一、试剂 1. lb（luriabertani）培养基 配制每升培养基，应在950ml去离子
3、水中加入： 细菌培养用胰化蛋白胨 10g 细菌培养用酵母提取物 5g 氯化钠 10g 摇动容器直至溶质完全溶解，用5 mnaoh（约0.2ml）调至ph7.0，加人去离子水至总体积为1 000ml，高压灭菌20分钟。 2. lb（20葡萄糖） 100ml lb中加人20g葡萄糖 3.1m cacl2 cacl26h2o 54g 去离子水 200mi 用0.22m过滤器过滤除菌，分装成1ml，贮存于-20。 4. 50mm cacl2 将1m cacl2稀释20倍即可。 5. 50mm cacl2(含20甘油) 取20ml甘油加50mm cacl2至100ml。6. 10cm 100mm cac
4、l2，400mm mgcl2，5mm trishcl（ph7.5）1m cacl2 10.0ml 0.5 m mgcl2 80 .0ml 1m trishcl (ph7.5) 0.4ml ddh2o 100.0ml二、仪器 1. 台式高速离心机 2. 空气震荡摇床 3. 紫外分光光度计 4. 恒温水浴 5. 培养皿实验内容及方法 一、e. coli感受态细胞的制备（氯化钙制备法） 1. 将27培养的e. coli 5ml加入到含有20葡萄糖的500ml lb培养基中； 2. 27震荡培养2小时； 3. 取1ml培养液，在波长600nm下测定其od值为0.20.3（以h2o为对照）； 4. 0下
5、放置30分钟后，4 3 000rpm离心5分钟，弃上清； 5. 沉淀中加 250ml 50mm cacl2使之悬浮； 6. 0下放置60分钟后，4 3 000rpm离心5分钟，弃上清； 7. 沉淀中加20ml含有20甘油的 50mm cacl2； 8. 分装，-70冰冻或液氮中保存。 二、质粒的转化 1. 取实验*制备的质粒dna 5l于eppendorff管中，加10cm5l，再加水至50l； 2. 冰浴上放置12分钟后，加入上述制备的e. coli感受态细胞50l； 3. 0放置15分钟，25放置4分钟，0放置5分钟； 4. 室温放置 5分钟后，加 lb培养基 500l（总体积 600l）； 5. 37保温1小时后，铺板（每块培养皿50l或100l）； 6. 37培养过夜。 实验结果与分析总结实验，统计质粒dna的转化情况。
