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1、四倍体鱼苗诱导试验及结果分析 半滑舌鳎(Cynoglossussemiliaevis)属鲽形目(Pleuronectiformes)、舌鳎科(Cynoglossidae)、舌鳎属(Cynoglossus),俗名鳎米、舌头鱼、龙利等,是中国特有的名贵经济海水鱼类,以黄海、渤海为多。由于半滑舌鳎其肉质细嫩、味道鲜美、营养丰富,深受广阔消费者青睐,市场价值极高,养殖前景非常广阔,已与大菱鲆、牙鲆、星鲽等成为中国北方重要的海水养殖鱼类。研究说明,半滑舌鳎雌性个体和雄性个体在生长速率上存在很大差异,其雌性个体比雄性同龄个体大34倍【1】,半滑舌鳎鱼苗经过1.52年的养殖后,雌性个体可达500750g,而
2、雄性个体那么只有50150g。由于雄性个体生长过慢,降低了半滑舌鳎的养殖产量,增加了养殖本钱,严重影响了半滑舌鳎苗种的推广及养殖产业的开展,因此,培育优质、高产、抗逆性强的新品种,对于半滑舌鳎苗种的推广及其养殖业的开展具有重要意义。鉴于半滑舌鳎的养殖潜力和潜在的经济社会效益,我国科技工作者对半滑舌鳎生殖调控和自然产卵技术进行了大量研究工作,主要采取人工控温控光的方法刺激亲鱼成熟和自然产卵,半滑舌鳎苗种的生产已经实现规模化23。近年来,国内学者又对半滑舌鳎雌核发育和性别控制技术进行了系统的研究,筛选出半滑舌鳎雌性特异AFLP分子标记,建立了半滑舌鳎遗传性别鉴定的PCR技术【4】,建立了半滑舌鳎异
3、源精子和同源精子诱导的雌核发育技术56,从而局部解决了半滑舌鳎雄性生长缓慢的问题,而这些技术主要是进行半滑舌鳎遗传性别鉴定和雌核发育诱导。三倍体鱼因染色体组成不平衡,性腺不能发育成熟,理论上可将生殖腺发育消耗的能量用于生长,提高生长速度。鉴于此,2004年陈松林等【7】用静水压成功诱导出半滑舌鳎三倍体,对半滑舌鳎的性腺发育进行调控,但是三倍体鱼的诱导只能当代使用,影响了其规模化推广应用。为了大规模生产半滑舌鳎不育三倍体鱼苗,最理想的途径是先培育出四倍体鱼,然后与二倍体进行交配,从而大量生产三倍体鱼苗。人工诱导鱼类四倍体在水产动物遗传育种中具有重要的意义。四倍体鱼可以用自交的方法保存其四倍体种群
4、,也可以与普通二倍体交配而获得三倍体,在水产养殖中具有广阔的应用前景。中国鱼类多倍体育种研究起于20世纪70年代中期8。1976年中国科学院水生生物研究所首次报道了用理化方法获得了草鱼(Ctenopharyngodonidellus)三倍体和四倍体,迄今已对虹鳟(Oncorhy-nchusmykiss)910、鳙(Aristichthysnobilis)11、水晶彩鲫(Carassiusauratus)12、罗非鱼(O.mossam-bicus)13等鱼类进行了四倍体诱导的研究,异源四倍体鲫鲤已经建立了亲鱼群体并且在三倍体育种中得到了广泛的应用14。但是迄今为止,有关半滑舌鳎四倍体鱼苗的人工诱
5、导,国内外尚未见报道。1材料与方法1.1实验用鱼和人工授精实验用半滑舌鳎亲鱼,由山东省海阳市黄海水产提供,雌鱼体质量为1.52kg,雄鱼体质量180350g,经过生殖调控到达性成熟后,按照陈松林等15已建立的人工催产方法进行人工催产。采取挤压腹部法收集半滑舌鳎未受精卵和精液,采用干法授精,将新鲜精液倒入卵中,轻轻摇动混匀,然后参加2倍于卵量体积的海水(230.2)中完成授精过程。1.2静水压处理适宜起始时间的筛选根据预实验,在授精后19.5min、21.5min、23.5min、25.5min和27.5min的不同时间,将受精卵置于日本生产的5506静水压机的压力缸中,压力设为40MPa,休克
6、处理起始时间设为4.5min,休克处理完毕后将卵移入2223海水中培养孵化。在鱼苗孵化出膜后,分别计算不同时间组四倍体鱼苗的孵化率及四倍体率,从而确定静水压处理的适宜起始时间。1.3静水压处理压力和适宜处理时间确实定确定静水压休克起始时间后,设定静水压压力梯度为36MPa、38MPa、40MPa、42MPa和44MPa,持续处理4.5min,处理完毕后将卵移入2223海水中培养孵化。分别计算不同压力组的孵化率及四倍体比率,从而确定静水压处理的适宜压力。最后根据上两个实验结果筛选静水压处理持续时间,设定梯度为4min、4.5min、5min、5.5min和6min,进行静水压休克处理,处理完毕后
7、将卵移入2223海水中培养孵化。计算各组的孵化率及四倍体比率,从而确定静水压处理的适宜处理时间。1.4半滑舌鳎四倍体鱼苗细胞DNA相对含量的测定每次四倍体诱导实验,抽检孵化出膜后25d的四倍体鱼苗2030尾。将每尾鱼苗放入1个1.5mL的离心管中,用蒸馏水清洗12次,随后向每个离心管参加0.2mLPBS,用碾磨棒将鱼苗碾碎,制成单细胞悬液,碾磨下一个前先将碾磨棒在蒸馏水中清洗干净。全部磨好后,向每个管中参加12mL从PARTEC公司购置的一步法染色试剂,染色5min后,用滤膜过滤,将滤液转入仪器配套的5mL试管中,轻弹试管,使细胞悬液混合均匀,然后将试管置于PARTEC倍性测定仪(PA)中测定
8、样品的DNA相对含量。采用正常二倍体鱼苗作对照,再分析四倍体诱导鱼苗的DNA相对含量。统计四倍体鱼苗的比率。1.5四倍体鱼苗染色体分析半滑舌鳎四倍体鱼苗染色体制作过程主要参照张四明16、周丽青等17所用方法,并有所改进。首先将25日龄的四倍体鱼苗置于海水配置的0.02%的秋水仙素中游泳12h,然后把鱼苗放入0.075mol/L的KCl中低渗30min。用新配制的预冷卡诺氏液(甲醇+冰醋酸体积比31)连续固定3次,每次20min。再取单个鱼苗放入50%的冰醋酸中,用镊子铗碎,使细胞游离。热滴片法滴片。10%吉姆萨染液染色2030min。镜检。1.6数据分析运用SPSS13.0软件统计各个组诱导鱼
9、苗孵化率和四倍体率的平均值和标准差,并进行单因素方差分析(one-wayANOVA),利用最小显著差数法(leastsignificantdifference,LSD)对各个诱导组间的数据进行多重比较。2结果与分析2.1静水压处理适宜起始时间的筛选比较了静水压处理不同起始时间对半滑舌鳎四倍体诱导率的影响,现将不同起始时间组的舌鳎四倍体诱导结果示于图1。由图1可见,在受精后21.525.5min进行静水压处理,都有60%70%的四倍体鱼苗产生,且不存在显著差异(P0.05),而只有在21.5min时,鱼苗孵化率最高,且获得四倍体鱼苗的比例也最高,到达68.3%,因此确定半滑舌鳎四倍体鱼苗诱导的最
10、正确有效起始时间为受精后21.5min。2.2静水压压力及其持续时间确实定不同静水压压力下半滑舌鳎四倍体诱导率所受的影响如图2所示,随着静水压力的增加,鱼苗孵化率呈下降趋势。处理压力低于40MPa时,四倍体出现率太低,高于40MPa时虽然四倍体率有所增加,但是鱼苗孵化率极低,因此确定半滑舌鳎四倍体诱导适宜的静水压压力为40MPa。最后根据上述两个实验结果筛选静水压处理持续时间,将梯度范围设在46min,受精后21.5min,进行静水压休克处理。实验结果说明，半滑舌鳎受精卵在40MPa压力下休克处理45.5min,均有鱼苗孵化出膜。随着压力持续时间的增加,四倍体鱼苗的比例有较小幅度的增加,但是孵
11、化率却明显下降,综合考虑,只有在休克持续处理4.5min时,诱导四倍体鱼苗的效果最好(图3)。2.3半滑舌鳎四倍体鱼苗细胞DNA相对含量的测定利用流式细胞仪对实验获得四倍体鱼苗和对照组鱼苗的细胞DNA相对含量进行了测定。说明二倍体鱼苗细胞中的DNA相对含量绝大多数集中在26处左右,而四倍体鱼苗绝大多数细胞中的DNA相对含量在52处左右,是二倍体鱼苗的2倍(图4),因此证明我们诱导出的鱼苗为四倍体鱼苗,统计四倍体率。2.4半滑舌鳎四倍体实验鱼苗染色体分析半滑舌鳎二倍体鱼苗的染色体数目为2n=42条;而四倍体鱼苗的染色体数目应为4n=84条,因此通过染色体分析即可鉴定诱导出的鱼苗是否为四倍体鱼苗。
12、本项研究采用鱼苗染色体制片方法,对人工诱导的半滑舌鳎四倍体鱼苗进行了染色体分析,发现在优化的静水压处理条件下产生的鱼苗局部含有84条染色体,是正常二倍体鱼苗的2倍,因此,含有84条染色体的鱼苗就是四倍体鱼苗(图5)。3讨论三倍体鱼因染色体组成不平衡,性腺不能发育成熟,防止了性腺发育时期生长停滞和鱼肉质量下降等不利影响,对提高养殖产量和鱼肉质量具有重要的意义。王磊等18对牙鲆三倍体的生长和性腺发育研究发现,三倍体成鱼性腺发育不良,并且其生长速度显著快于二倍体;张涌泉19对虹鳟三倍体和二倍体鱼肉品质分析,发现三倍体比二倍体的脂质含量高,而且二龄鱼时三倍体的鱼肉嚼感比二倍体柔软。三倍体鱼类的不育性,
13、对鱼类天然种质资源的保护也具有重要的意义。然而,三倍体鱼的诱导只能当代使用,不能建立繁殖群体,难以大规模推广应用,最好的方法是首先诱导获得四倍体鱼,然后与普通二倍体鱼杂交,就可以大量稳定的获得100%的三倍体,在水产养殖中具有广阔的应用前景。人工诱导鱼类四倍体技术是通过抑制受精卵早期卵裂使染色体加倍,从而形成四倍体个体。目前广泛应用的诱导方法有物理学方法、化学方法和生物学方法。静水压处理虽然需要专门的设备,但是其处理的最正确条件易于掌握,处理时间较短,对胚胎的损伤比温度休克法小,是进行鱼类染色体组操作的有效方法。早在1981年,Streisinger等20就成功的用静水压处理与乙醚相结合诱导斑
14、马鱼雌核发育产生纯合二倍体;桂建芳等12,21采用静水压处理分别获得了批量三倍体和少数四倍体水晶彩鲫;尤锋等22采用冷休克和静水压两种方法对牙鲆同质雌核发育诱导进行研究发现,静水压法诱导的效率最高达13.08%,远高于温度休克法的诱导率(最高缺乏1%);在真鲷和欧鲈的雌核发育和四倍体诱导过程中也都报道,静水压法诱导的效率要远高于温度休克法的诱导2324。本研究采用静水压法,通过屡次实验,筛选出诱导半滑舌鳎四倍体鱼苗的最正确条件为,孵化水温(230.2)左右,授精后21.5min,静水压力40Mpa,持续处理4.5min,诱导效果最正确,鱼苗四倍体率达68.3%。本研究对出膜仔鱼进行四倍体率统计
15、,得到这一结果较许多鱼类都高。如孙静娴等10用热休克诱导虹鳟四倍体,胚胎时统计四倍体率最高为33%;容寿柏等13用热休克诱导罗非鱼四倍体,在仔鱼和幼鱼中四倍体所占比率分别为38.3%和30%;郑春静25分别用冷、热休克法诱导大黄鱼四倍体,鱼苗的四倍体检出率分别仅为1.25%和3.06%。本研究中,作者发现半滑舌鳎四倍体的诱导效果要明显低于三倍体的诱导效果,而且很多鱼类也是如此,究其原因可能有多个：一是受精卵的发育过程具有不同步性,半滑舌鳎卵从受精后发育到第一次卵裂所需要的时间要远远大于发育到第二极体释放所需要的时间,受精卵的发育更易不同步,从而导致诱导出的鱼苗不能全部是四倍体;二是因为四倍体胚
16、胎及鱼苗比二倍体鱼更易死亡,这就导致幼鱼和成鱼的四倍体率远低于胚胎时四倍体率,诸多学者对此进行了分析研究2627;还有亲鱼的发育状态、卵子的质量及诱导工艺等也是影响多倍体诱导效果的重要因素。实验中还发现,用静水压抑制半滑舌鳎第一次卵裂所需要的压力要稍高于抑制第二极体释放所需要的压力,Bertotto等24用静水压诱导欧鲈减数雌核发育时所用最适强度为550kg/cm2,而诱导其卵裂雌核发育时压力强度那么为600kg/cm2,尤锋等22诱导牙鲆雌核发育时也有相同报道,造成此种差异的原因尚不清楚。本研究对静水压诱导半滑舌鳎四倍体的条件和方法进行了探讨,在国内外首次建立了人工诱导半滑舌鳎四倍体的技术,采用流式细胞仪鉴定
