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1、去壁低渗法制备植物染色体标本实验一、实验目的：1、掌屋植物染色体标本的去壁低渗方法2、了解中期染色体的形态结构二、实验原理：植物细胞有很坚实的细胞壁，染色体很难像动物染色体那样平整地贴在载玻片上，可通过纤维素酶和果 胶酶处理去掉细胞壁；用低渗溶液处理可以提高染色体的分散程度。陈瑞阳等（1979，1982）提出了植 物染色体标本制备的酶解去壁低渗法，并在多种植物上得到广泛应用，成为当前植物染色体研究中的重要 方法。三、实验用品：（一）器材：显微镜；温箱；冰箱；重蒸水；眼科镊子；刀片；牙签；载玻片；试剂瓶；三角瓶；量筒；酒精灯；青 霉素小瓶（二）药品：1、0.2%秋水仙素溶液2、Giemsa原液:
2、取Giemsa粉0.5g加入33ml优质并三醇于研钵中，充分研磨1小时,然后在56匸温 箱中保温2小时,再加入33ml甲醇（GR或AR级）,混匀后装入棕色瓶中保存备用，贮存时间越久越好3、甲醇（AR级以上）4、冰醋酸（AR级以上）5、0.075mol/L氯化钾:称取氯化钾5.592g，置于容量瓶内加蒸馏水至1000ml6、磷酸缓冲液：A液：0.067mol/L磷酸氢二钾B液：0.067mol/L磷酸氢二钠用时将13mlA液和87mlB液混匀即得pH7.6的PBS液7、Giemsa染色液（染色前临时配制）：100mlPBS液+3-5mlGiemsa原液8、混合酶液：称取纤维素酶，果胶酶各0.5g
3、，加入20ml蒸馏水即为2.5%混合酶液，冰箱内冰冻保存四、实验材料:大麦或玉米种子五、方法步骤：1、材料培养：将玉米或大麦的种子充分浸种后，摆在铺有滤纸的培养皿内，在25C温箱发芽培养2、预处理：待根长至0.5-1cm时，切取根尖立即放入盛有1ml0.2%秋水仙素的小瓶中预处理2-3小时3、前低渗：切取分裂旺盛的部分根尖（1mm），放入0.075mol/L氯化钾低渗液中，在25C条件下 处理 30 分钟。以下可分两种方法进行处理4、第一种方法：（1）、酶解去壁：吸去氯化钾溶液，加入混合酶液（2ml滴管5滴左右），在25C下处理1-2小时。（2）、后低渗：吸去酶液，慢慢加入（250.5） C的
4、双蒸水,轻轻洗一次,然后在双蒸水中浸泡10-30 分钟5、第二种方法：（1）吸去前低渗液，立即加入甲醇：冰醋酸（3： 1）固定液固定20-30分钟(2) 水洗：将固定好的材料用蒸馏水洗三次，除去材料中的固定液(3) 酶解去壁：在小瓶内加入混合酶液(酶液量以浸过材料为合适)，在25C下酶解30-60分钟(4) 后低渗：同4、(2)，但是，可适当延长时间至1-1.5小时。6、经过上述两种方法处理的材料,可用两种方法制备染色体标本1) 、第一种方法,涂片法:(1) 固定：将后低渗好的材料，直接用甲醇：冰醋酸(3： 1)固定液固定30分钟以上(2) 涂片：将材料放在预先用蒸馏水浸泡并冷冻的清洁载玻片上
5、，加1 滴固定液，然后用镊子迅速将材 料夹碎涂布，并去掉大块组织残渣( 3 )火焰干燥：立即将载玻片在酒精灯火焰上微微加热烤干(4)染色：经干燥的玻片标本，用Giemsa染色液染色30分钟，然后用自来水细流冲洗，甩干水珠空 气干燥。2 )、第二种方法，悬液法：(1) 制备细胞悬液：倒去双蒸水，用镊子立即将材料夹碎形成细胞悬液(2) 固定：向细胞中加入新配制的甲醇：冰醋酸(3： 1)固定液1-2ml,使成细胞悬液(3) 去沉淀：静置片刻使大块组织沉淀，然后取上层细胞悬液于另一个小瓶中。(4) 去上清夜：将上层细胞悬液静置30分钟左右，即可见细胞沉淀，用吸管轻轻吸去上清夜，留约0.5ml 左右细胞
6、悬液置备标本取材预处理前低渗(5)标本制备:在一张经过充分洗净脱脂,并预 先在蒸馏水中冷冻的清洁载玻片上,用吸管滴 2-3 滴细胞悬液,立即将载玻片一端抬起,并 轻轻吹气，使细胞迅速分散，然后在酒精灯 火焰上微微加热烤干。(6)染色：同涂片法(4)7、在显微镜下寻找典型的中期染色体，注 意观察中期染色体的长臂、短臂和着丝粒位 置，并尽可能找到具随体染色体。实验步骤流程如下：后低渗涂片法悬液法制备细胞悬液固定固定J去沉淀详片.细胞悬液IJ去上渚火焰干燥火焰干燥制片1 、Giemsa染色Giemsa染色弹洗冲洗*空气干燥空气干燥镜检镜检六、注意事项：1 、预处理是很重要的一个步骤，必要时可 将预处理药品直接加到培养皿内进行活体处 理 34 小时，以便获得更多的中期分裂相。
