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1、卵巢上皮性肿瘤DNA倍体分析及 P53 表达意义【摘要】目的：观察卵巢上皮性肿瘤(EOT)患者核DNA含量、P53蛋白表达情况,研究其与生物学行为之间的关系及临床鉴别诊断的意义。方法：采用流式细胞术对162例卵巢上皮性肿瘤(EOT)石蜡包埋组织进行肿瘤单细胞DNA倍体分析；同时,采用流式细胞术对P53蛋白表达进行检测。结果：53例良性肿瘤DNA倍体检测均为二倍体；43例交界性中检出异倍体11例,二者有显著差异。恶性EOT与交界性EOT和良性EOT比较均有显著差义。P53阳性表达恶性EOT与交界性EOT和良性EOT比较均有显著差义。显著高于后二者(X2=34.719,P0.001)。结论：P53
2、阳性表达与DNA异倍体密切相关,可能是肿瘤发生的机制之一。 【关键词】 卵巢上皮性肿瘤DNA倍体分析流式细胞术基因P53Abstract Purpose:To observe the nuclear DNA contents and P53 expression of the patients with epithelial oarian tumors (EOT) and to study the biological behaviors and the clinical significance of the differential diagnosis.Methods:Tumor sing
3、le-celled DNA ploidy were analyzed by flow cytometry for 162 paraffin specimens of EOT,as well as the expression level of P53.Results:DNA ploidy of 53 cases with benign tumor were diploid.11 cases of heteroploid were detected in 43 specimens of borderline tumor.There were significant differences bet
4、ween aforementioned groups.Malignant EOT compared with borderline EOT and benign EOT were significant different,as well as the positivity of P53.Conclusions:The positive expression of P53 and DNA heteroploid are closely related,and might be one of the mechanisms of oncogenesis.Key Words epithelial o
5、varian tumor;DNA ploidy analysis;flow cytometry;gene;P53 卵巢来源的良、恶性肿瘤是临床常见肿瘤，以组织细胞学形态为主要根据判断其良、恶性有时相当困难。本研究采用流式细胞术对良、恶性卵巢肿瘤进行DNA倍体检测分析，同时佐以免疫组化法检测P53表达，以探讨其与组织细胞学形态的关系和对临床鉴别诊断的意义。 资料与方法 20032009年确诊为卵巢肿瘤的石蜡包埋组织标本162例，年龄3568岁，平均4812岁。162例EOT中，卵巢浆液性肿瘤77例，其中良性囊腺瘤21例，交界性囊腺瘤24例，浆液性囊腺癌32例；卵巢黏液性肿瘤85例，其中良性囊腺瘤
6、32例，交界性囊腺瘤19例，黏液性囊腺癌34例。所用组织学标本均为石蜡包埋病理组织。 流式细胞术：石蜡包埋组织的单细胞悬液的制备：50μm厚的石蜡包埋组织连续切片5张，经二甲苯脱蜡48小时；体积分数1.00、0.95、0.70、0.50的梯度乙醇水化；加入3ml胶原酶消化液，置37恒温水浴中作用消化30分钟；尼龙网过滤，收集细胞悬液，1500转/分钟离心沉淀；PBS液漂洗，1000转/分钟离心沉淀。全部病例均制备细胞悬液涂片，保证镜下观察保留完整的细胞核；再行核酸染料标记DNA(DNA倍体分析试剂，BECKMAN COULTER公司)；30分钟后上流式细胞仪进行检测分析，获得细胞各个时期
7、的分布状态，计算出G0/G1%，S%及G2/M%。DNA倍体分析：采用细胞周期和DNA分析软件(MultiCycle AV for Windows advancedDNA Cell Cycle Analysis Sof tware)进行各项指标的分析。DNA指数(DI)在1.02CV之间(0.901.10)为二倍体，不在1.02CV之间为异倍体。 免疫组化检测：一抗为鼠抗人P53单克隆抗体(购自SANTACRUZ公司)，工作浓度为1100，实验参照说明书的方法步骤进行操作，以乳癌P53阳性病例作为阳性对照。阳性判断标准：P53阳性信号呈棕黄色颗粒状，位于细胞核；阳性细胞数1%为阴性，1%24%
8、为阳性。 统计学处理：采用SPSS 10.0统计软件进行X2检验、精确概率法检验以及Spearman等级相关检验。 结 果 EOT患者核DNA含量的测定结果及P53蛋白的表达情况：交界性EOT与良性EOT比较AT和P53蛋白阳性率P值均0.01，交界性黏液性EOT与交界性黏液性EOT比较AT阳性率P值0.05，P53蛋白阳性率P值均0.01；癌性EOT与良性EOT和交界性EOT比较AT和P53蛋白阳性率P值均0.01。见表1。表1 EOT的核DNA含量、P53蛋白表达(略)注：#P0.05，*P0.01 讨 论 P53基因和P53蛋白表达是目前广泛研究的课题。P53抑癌基因的突变以及蛋白的失活
9、是肿瘤发生过程中较为普遍的分子现象。Costa等1研究认为P53的高表达是与P53基因错义点突变有极强的相关性。当正常的细胞的DNA受到外源性或内源性因素损伤时，P53蛋白含量会升高，诱导受损的细胞G1期阻滞和程序性凋亡2,3。当细胞修复或被清除时，P53蛋白含量在存活的细胞中又恢复到正常的水平。突变型的P53蛋白在DNA受损伤时也会升高，却没有此功能，受损细胞继续分裂，P53不断产生，导致大量积累。因此当细胞大多数表示为P53蛋白高表达时认为是P53突变型，而少量细胞高表达时，则认为是野生型的P53的正常工作状态4。 DNA异倍体的形成，是一个多基因、多步骤相互作用的结果，已有很多报道表明，
10、DNA倍体与临床分期、增殖和预后有关6。流式细胞仪是用来研究P53表达和DNA倍体的双参数的最简便和最直观的方法。我们用D0-1单抗标记P53蛋白以及用PI染色DNA，检测71例临床标本，目的是为了研究P53表达和DNA倍体关系以及临床意义。实验发现，P53阳性表达与异倍体之间有极明显的相关。DNA异倍率越高，P53阳性表达率越高。这在很多的肿瘤研究中都得到了相同的结果610。DNA的重排畸变会引起基因的不稳定性，异常的DNA倍体会出现在癌前病变细胞中。基因不稳定引起编码蛋白的失活，不能修复和排除DNA异变细胞，使DNA异常细胞克隆型生长。DNA含量与癌基因蛋白相互关系分析，可能找出诱导细胞转
11、化的原因。我们结合临床的生物学指标，良性肿瘤无1例表达P53阳性，恶性肿瘤阳性P53表达两者比较有明显差异(P0.05)。参数分析，P53阳性表达与异倍体明显相关(P0.001)，与肿瘤良恶性相关。在病理分级的研究中，低分化和中分化肿瘤倍体和P53阳性表达没有明显差异。比较3种不同恶性程度的肿瘤，异倍体率和P53阳性表达率，但没有明显差异，与EOT的恶性程度明显相关。 综合以上分析，我们认为P53阳性表达与DNA异常密切相关，可能就表达了一种机制，即抑癌基因蛋白失活，不能修复和排除DNA异变细胞，形成肿瘤发生及生长。【参考文献】 1Costa A,Marasca R,Valentinis B,
12、et al.P53 gene point mutation in relation to P53 nuclear protein accumulation in colorectal cancer.J of Pathol,1995,176(1):45.2Robert B,Carol C,PhilipB,et al.Increasedaccumulation of P53 protein in cisplatin resistant ovarian cell Line.Int J Cancer,1993,55(4):678.3Philip J,Coates,Vicki S,et al.Demon
13、st ration of DNA damage/repair in indioidual cells using in site end labelling:Association of P53 with sites of DNA damage.J of Pathol,1995,176(1):19.4Bass IO,Mulder J R,Offerhaus GA,et al.An evaluation of six antibodies for immunohistochemically of mutant P53 gene product in archival coloerctal neo
14、plasmas.J of Pathol,1994,172(1):5.5Khoos K,Hurst T,Keasley J,et al.Prognostic significance of tumor ploidy in patient with advanced ovarian carcinoma.Gynecol Oncol,1990,39(2):284.6丁志杰,单吉贤,徐惠绵,等.直肠癌远端肠管、直肠系膜内DNA含量的检测及其临床意义.肿瘤,2004,24(4):392.7郝风云,张景芳,张采欣,纪祥瑞.周围神经肿瘤DNA倍体分析及P53表达意义.齐鲁医学杂志,2009,24(3):223
15、.8Feranando CS,Conceigao L,Carlos L,et al.P53 protein expression and nuclear DNA content in the breast intraductal proliferation.J of Pathol,1995,76(3):233.9李豪侠,林三仁,王润田,等.流式细胞光度术分析胃癌石蜡标本及P53蛋白含量测定.北京医科大学学报,1995,27(4):256.10De Angelisp,Stokke T,Smedshammer L,et al.P53 expression isassociated with a high degree of tumor DNA aneuploid and incidence of P53 mutation and localized the aneuploid component in colorectal carcinomas.Int J Oncol,1993,3(2):305.作者：刘志跃作者单位：610200四川成都市双流县第一人民医院急诊科
