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1、一、 绪论干细胞用途：用于药物的研究或毒性的检测。实验室中研究基因的控制与表达。可以用来分化培养一些治疗细胞。（一） 名词解释1. 细胞工程制药：根据细胞生物学和工程学原理，运用体外细胞培养技术定向改变细胞遗传特征，建立和创建新型细胞系（株），并通过专门的细胞培养方法研究细胞生命现象和活动规律，采用工程化的大规模细胞培养方法，探索生产方法和工艺，制造药用生化和生物制品。（1）细胞培养基本技术 （2）细胞工程常用技术 （3）细胞工程制药应用技术2. 生物工程：以生命科学为基础，利用生物体系和工程学原理生产生物制品和创造新物种的一门综合技术。第一代生物工程 近代生物工程 现代生物工程（1）发酵工程
2、 （2）酶工程 （3）蛋白质工程 （4）基因工程（5）细胞工程：以细胞为基本单位或人为地使细胞某些生物学特性按人们的意愿发生改变，从而达到改良生物品种或创造新品种；或加速繁育动、植物个体；或获得某种有用的物质的过程。、植物细胞工程 、动物细胞工程 、微生物细胞工程3. 细胞与组织培养：生物细胞和组织在离体条件下的生长和增殖。 体外（in vitro）培养细胞工程的最基本技术4. 细胞核移植：利用显微操作技术将细胞核与细胞质分离，然后再将不同来源的核与质重组，形成杂种细胞。5. 胚胎工程：以生殖细胞和胚胎细胞为对象进行的操作，主要技术包括体外受精、胚胎切割、胚胎移植等。6. 干细胞：动物体内具有
3、分化潜能，并能自我更新的细胞。（1）胚胎干细胞：来自囊胚期的细胞团，属于全能干细胞，每个细胞可以发育成为完整的个体。（2）组织干细胞：存在于成体组织中，属单能或多能干细胞，可以定向分化为一种或几种不同的组织。7. 细胞重组：细胞融合技术与细胞核质分离技术结合，在融合介子诱导下，使胞质体与完整细胞合并，重新构成胞质杂种细胞的过程。（二） 动物细胞培养标志性事件&人物A.Barli 细胞融合 1859 黏虫生活史首例克隆动物成功的报道 1962 非洲爪蟾小肠上皮细胞的核（未受精卵）（三） 脱分化&再分化1. 脱分化：一个成熟细胞转变为分生状态的过程。恢复细胞的分裂活性。高度分化的细胞，通过诱导后，
4、失去其特定结构和功能而转变成未分化细胞（愈伤组织）的过程。2. 再分化：经脱分化的组织或细胞在一定的培养条件下转变为各种不同细胞类型的过程。脱分化产生的愈伤组织继续进行培养，又可以重新分化成根或芽等器官，这个过程叫做再分化。（四） 植物细胞工程的基础细胞全能性二、 细胞工程基础（一） 实验室设置&仪器（6个分区）实验室是细胞工程研究的主要场所，应能满足：清洗 培养基制备 灭菌 储藏无菌操作 培养；等方面工作。1. 基本实验室设置（1）清洗室 （2）制备室 （3）灭菌室 （4）储藏室（5）无菌操作室：实验材料接种操作，又叫接种室。更衣间：鞋帽架、口罩缓冲间：水槽、小型仪器接种间（无菌间）：超净工
5、作台、紫外灯、接种器械（6）培养室细胞培养（动物、植物）2. 辅助实验室设置（1）鉴定室对培养材料进行细胞学鉴定和研究（2）生化分析室分析化验培养细胞产物（3）温室驯化移植3. 常用仪器与设备（二） 实验室污染1. 污染：混入培养环境中的、对细胞生存有害或造成细胞不纯的物质，包括微生物和化学物质。（1）细菌污染表现：变浑浊，pH改变。胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡。（2）真菌污染表现：培养液中漂浮着白色小点，一般不浑浊。倒置显微镜下可见菌丝排列。念珠菌和酵母菌呈卵形散在细胞周边和细胞之间。（3）支原体污染表现：不易发现。电镜下可见其三层结构。部分敏感细胞生长变慢，部分变圆，从瓶壁脱落。但
6、多数无明显变化。（4）病毒污染：采用组织细胞培养法生产疫苗，如没除去潜在病毒的组织培养物，会产生病毒污染。（5）非同种细胞污染（6）非细胞培养物污染（化学物质）2. 污染的鉴别（1）细菌、真菌污染的检测：肉眼观察 镜下观察 接种观察（2）支原体污染的检测：最常用电镜观察（地衣红染色）3. 污染的清除（1）使用抗生素：预防比污染后再用好。联用比单用好。（2）加温处理：支原体41（3）使用支原体特异性血清（4）其他方法三、 动物细胞与组织培养（一） 定义1. 动物细胞培养：从体内取出组织，模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存和生长，并维持其结构和功能的方法。 常泛指：所有体
7、外培养的统称。 分类：器官培养、组织培养、细胞培养2. 细胞培养：用机械或化学的方法将组织分散成单个细胞而进行的培养。（1） 群体培养：将大量细胞置于培养瓶中，让其贴壁或悬浮生长，形成均匀的单细胞或单细胞悬液。（2） 克隆培养：将少数的细胞加入培养瓶中，贴壁后彼此间隔距离较远，经过繁殖每一个细胞形成一个集落，称为克隆。3. 组织培养：把活体的组织取出分成小块，直接置于培养瓶底或通过胶原纤维血浆支持物的培养瓶底来进行培养。4. 器官培养：将活体中器官或一部分器官取出，在体外生长、生存，并使其保持器官原有的结构和功能特征的培养。优点：理化环境可控。细胞经培养后特征均一。培养物可直接被观测。提供大量
8、均一的细胞供制备用。便于进行人工筛选。缺点：与体内环境仍存一定差异，细胞形态或功能会发生改变。防止污染、无菌操作是动物组织培养成功的关键！动物细胞的特性（和微生物比较）：大，无细胞壁。生长慢，易污染。需氧量少，对剪切力敏感。以聚集体存在。原代50代死亡。（二） 标志性事件Carrel 鸡胚浸出液 细胞生长促进效应 无菌技术引到组织培养技术中Thomson 1914 器官培养法Earle 1940 无限传代 C3H小鼠的结缔组织细胞系1. 开始：1907 Harrison用蝌蚪的髓管放于一滴淋巴液内，培养出神经元。2. 成熟：以人的肿瘤组织为材料建立的各种细胞系，如Hela细胞系。3. 研究内容
9、：细胞内活动和流动，外界对其影响，细胞间互相作用等。4. 关键：无菌操作。（三） 体外培养细胞的分型（根据：形态特征）1. 贴附型细胞：（1）成纤维型 （2）上皮型 （3）游走型 （4）多形型2. 非贴附型（悬浮型）细胞（四） 接触抑制&密度抑制1. 接触抑制：细胞从接种到长满底物表面后，由于细胞繁殖数量增多相互接触后，不再增加。2. 密度抑制：培养细胞一代生长过程。（1）游离期 （2）指数生长期 （3）稳定期 （4）衰退期（五） 培养群体生命图（六） 原代培养期&传代培养期1. 原代（初代）培养期：从新鲜供体取得组织细胞后在体外进行首次培养，一般持续14周。 特点：（1）细胞移动较活跃。（2
10、）异质性。（3）细胞与体内相应细胞性状相似。 （4）是检测药物的很好实验工具。2. 传代培养期：当原代培养的细胞相互汇合时，细胞由原培养瓶消化、收集、稀释后传到新的培养瓶的过程。（七） 细胞株&细胞系1. 细胞系：原代细胞经第一次传代后，形成的细胞群体，即具有增殖能力，类型均匀的培养细胞，一般为有限细胞系。原代培养后得到细胞系，再经多次传代培养后，一部分细胞死亡，一部分细胞继续生长并转化为连续细胞系或无限细胞系。2. 细胞株：细胞系经过克隆或其他方法而得的单一类型的细胞群体。（八） 动物细胞培养条件1. 培养细胞的生存环境：（1）环境无毒和无菌。（2）适宜的温度：3537。（3）气体环境和氢离
11、子浓度：pH7.27.4。（4）渗透压。（5）营养物质。（6）其它。2. 培养液的营养成分：（1）氨基酸。（2）盐类：Na、K、Mg离子。（3）葡萄糖：供能。（4）缓冲系统。（5）生长因子。（6）其它成分。（九） BBS&常用液1. 天然培养基（血清、血浆、组织浸出液、水解乳蛋白）培养常用溶液：（1）平衡盐溶液（BSS）：PBS、Ringer 功效：维持渗透压。提供缓冲系统。提供水分和无机盐。（2）其它常用液：消化液：胰蛋白酶、EDTA、胶原酶溶液。HEPES氢离子缓冲剂：调节pH值。NaHCO3溶液：调节pH值。抗生素液：防止污染。2. 人工合成培养基：化学成分明确的培养基，便于重复和标准化
12、管理和控制。（1） 基本成分：氨基酸、维生素、糖、无机离子等。（2） 常用培养液：199培养液、Eagle培养液、RPMI1640培养液等。（十） 取材方式1. 分离法2. 消化法（十一） 组织块培养法&单层细胞培养法1. 原代培养（1） 原代细胞的培养：1）取材（幼体较成体、分化程度低较高、肿瘤细胞较正常易）2）分离：组织块分离机械法：切割分离法：适用组织块培养机械分离法：适用某些软组织如脑、胚胎和一些肿瘤等消化法：胰蛋白酶消化法：适用消化细胞间质较少的软组织、羊膜、上皮、肝、肾等胶原酶消化法：适用结缔组织螯合剂消化法（EDTA法）：适用消化分离传代细胞细胞悬液分离（血液、羊水、胸水、腹水）
13、：离心法（5001000rpm，510min）（2） 组织块培养法：粗切细切冲洗，自然沉降留少许BSS 翻转干涸法（置37温箱中）继续培养移入培养瓶中并吸净BSS 细胞生长 薄层营养液培养法培养24小时后补液（3） 单层细胞培养法（消化培养法）：切成23cm3小块静沉去上清加新消化液37消化（2030分钟）静沉去上清加营养液并吹打计数接种培养加培养液并吹打 第一步离心后：中和（BSS）离心 温消化加胰蛋白酶37消化14小时滤过清洗静沉去上清 离心去上清 冷消化加胰蛋白酶4消化624小时2. 传代培养（1）（首次）传代：使原代细胞经分散接种的过程。生长密度不高不能急于接种。胰蛋白酶消化注意时间。吹打要轻巧。pH不能高，宁可偏低些。首次接种细胞数量要多些。（2）常规传代：1）贴壁细胞：消化法 直接吹打法 刮除法 2）悬浮细胞：直接吹打法 自然沉降法（十二） 细胞档案的建立以美国ATCC细胞库的标准，必须有以下的鉴定数据，才能入库：组织起源和已经传代的代数 冻存液 细胞活力 培养液：培养基、血清和抗生素融解后细胞生长特性 接种存活率 细胞形态 核型 无菌检测：细菌、真菌等物种检测：检测同工酶谱 反转录酶检测 细胞建立者
