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1、蛋白质的分子量测定-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法目的要求学会SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法原理。掌握用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量的操作技术。实验原理:SDS是十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate ）的简称，它是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳 系统中能使蛋白质的氢键、疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与 SDS 的结合比为1.4g SDS/1g蛋白质），使各种蛋白质-SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远 超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质原有的电荷差别。这样就使电泳迁移率只取 决于分子大小这一因素，
2、于是根据标准蛋白质分子量的对数和迁移率所作的标准曲线，可求得未知物的分 子量。试剂和器材一、试剂30%分离胶贮存液：30g Acr,0.8g Bis,用无离子水溶解后定容至100mL，不溶物过滤去除后置棕色瓶贮 于冰箱。10%浓缩胶贮存液：10g Acr,0.5g Bis,用无离子水溶解后定容至100mL,不溶物过滤去除后置棕色瓶贮 于冰箱。分离胶缓冲液（Tris-HCI缓冲液PH8.9）:取1mol/L盐酸48mL，Tris 36.3g,用无离子水溶解后定容 至 100mL。浓缩胶缓冲液（Tris-HCl缓冲液PH6.7）:取1mol/L盐酸48mL, Tris 5.98g,用无离子水溶解后
3、定容至100mL。 电泳缓冲液(Tris-甘氨酸缓冲液PH8.3):称取Tris 6.0g,甘氨酸28.8g, SDS 1.0g,用无离子水溶解 后定容至 1L 。样品溶解液：取SDS 100mg,巯基乙醇O.ImL，甘油1mL,溴酚蓝2mg, 0.2mol/L, pH7.2磷酸缓 冲液0.5mL,加重蒸水至10mL (遇液体样品浓度增加一倍配制)。用来溶解标准蛋白质及待测固体染色液：0.25g考马斯亮蓝R-250,加入454mL 50%甲醇溶液和46mL冰乙酸即可。脱色液：75mL冰乙酸，875mL水与50mL甲醇混匀。10%过硫酸铵溶液；10%SDS溶液；1%TEMED。二、材料标准蛋白：
4、溶菌酶(Mr 14 300)、胰凝乳蛋白酶原(Mr 25 000)、胃蛋白酶(Mr 35 000)、卵清蛋白 (Mr 43 000)、血清白蛋白(Mr 67 000)等。按每种蛋白0.5-1mg/mL配制。可配成单一蛋白质标 准液,也可配成混合蛋白质标准液。二、器材DYCZ-24D 型垂直板电泳槽；移液管 1 mL (7 3), 5 mL ( 4), 0.5mL ( 1), 0.1mL ( 2)；烧杯100mL ( 2)；细长头的吸管；微量注射器。操作方法一、安装垂直板电泳槽1. 将密封用硅胶框放在平玻璃上,然后将凹型玻璃与平玻璃重叠；2用手将两块玻璃板夹住放入电泳槽内,玻璃室凹面朝外,插入斜
5、插板； 3用蒸馏水试验封口处是否漏水。二、制备凝胶板1 分离胶制备：取分离胶贮存液5.0mL, Tris-HCl缓冲液(PH8.9)2.5mL,10%SDS 0.20mL,去离子水10.20mL, 1 %TEMED2.00mL置于小烧杯中混匀，再加入10% 0.1mL过硫酸胺，用磁力搅拌器充 分混匀2min。混合后的凝胶溶液，用细长头的吸管加至长、短玻璃板间的窄缝内，加胶高度距样品模板 梳齿下缘约1cm。用吸管在凝胶表面沿短玻璃板边缘轻轻加一层重蒸馏水（约34cm），用于隔绝空 气，使胶面平整。分离胶凝固后，可看到水与凝固的胶面有折射率不同的界限。倒掉重蒸水，用滤纸吸去 多余的水。浓缩胶制备：
6、取浓缩胶贮存液3.0mL, Tris-HCI缓冲液（PH6.7） 1.25mL, 1%TEMED2.00mL, 4.60mL去离子水，10% 过硫酸胺0.05mL,用磁力搅拌器充分混匀。混合均匀后用 细长头的吸管将凝胶溶液加到长短玻璃板的窄缝内（及分离胶上方），距短玻璃板上缘0.5cm处，轻轻加 入样品槽模板。待浓缩胶凝固后，轻轻取出样品模槽板，用手夹住两块玻璃板，上提斜插板，使其松开， 然后取下玻璃胶室去掉密封用胶框，用 1%电泳缓冲液琼脂胶密封底部，再将玻璃胶室凹面朝里置入电泳 槽。插入斜插板，将电泳缓冲液加至内槽玻璃凹口以上，外槽缓冲液加到距平玻璃上沿 3mm 处。三、样品处理各标准蛋白
7、及待测蛋白都用样品溶解液溶解，使浓度为0.5mg/mL,沸水浴加热3分钟，冷却至室温备用。 处理好的样品液如经长期存放，使用前应在沸水浴中加热1分钟，以消除亚稳态聚合。四、加样一般加样体积为10 15pL （即2 10pg蛋白质）。如样品较稀，可增加加样体积。用微量注射器小心 将样品通过缓冲液加到凝胶凹形样品槽底部，待所有凹形样品槽内都加了样品，即可开始电泳。五、电泳将直流稳压电泳仪开关打开，开始时将电流调至10mA。待样品进入分离较时，将电流调至20 30 mA。 当蓝色染料迁移至底部时，将电流调回到零，关闭电源。拔掉固定板，取出玻璃板，用刀片轻轻将一块玻 璃撬开移去，在胶板一端切除一角作为
8、标记，将胶板移至大培养皿中染色。六、染色及脱色将染色液倒入培养皿中，染色1h左右，用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白区带清晰，即可 计算相对迁移率, 见图4.1。图4.1标准蛋白在SDS-凝胶上的示意图七、结果处理测量由点样孔至溴酚蓝及蛋白质带的距离（mm），计算相对迁移率（Rf）Rf =样品移动距离（mm）/溴酚蓝移动距离（mm）以标准蛋白分子量的对数作纵坐标，相对迁移率作横坐标制作标准曲线。根据样品蛋白质的相对迁移率从 标准曲线上查出其分子量。注意事项（1）用SDS-凝胶电泳法测定分子量时，每次测量样品必须同时作标准曲线，而不得利用另一次电泳的标 准曲线。（2）因SDS可吸附考马斯
9、亮蓝染料，染色前先用脱色液浸泡凝胶，洗去SDS。可使染色及脱色时间缩 短，并使蛋白带染色而背景不染色。若样品为水溶液，则需将样品溶解液的浓度提高一倍，然后与等体积样品溶液混合。思考题1用SDS-凝胶电泳法测定蛋白质分子量时为什么要用巯基乙醇？2是否所有的蛋白质都能用SDS-凝胶电泳法测定其分子量？为什么蛋白质含量测定法/蛋白质沉淀法/Western免疫印迹1 蛋白质含量测定法2 WESTERN PROTOCOL3 Western 免疫印迹（Western Blot）4 蛋白质沉淀法5 蛋白质提取的方法总汇1蛋白质含量测定法本实验的目的是学会各种蛋白质含量的测定方法。了解各种测定方法的基本原理和
10、优缺点。 蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种古老的经典方 法，即定氮法，双缩尿法（Biuret法）、Folin酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。另外还有一种近 十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford法）。其中Bradford法和Lowry法灵 敏度最高，比紫外吸收法灵敏1020倍，比Biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复杂，但较准 确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四 种方法测定，有可能得出四种不同的
11、结果。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。在选择方法时 应考虑：实验对测定所要求的灵敏度和精确度；蛋白质的性质；溶液中存在的干扰物质；测定所 要花费的时间。考马斯亮蓝法（Bradford法），由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。 一、微量凯氏（Kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之 分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例 其反应式如下：CH2COOH| + 3H2SO4 2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH3 （1）NH22NH3 + H2SO4
12、 （NH4）2SO4 （2）（NH4）2SO4 + 2NaOH 2H2O +Na2SO4 + 2NH3 （3）反应（1）、 （2）在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。为了加速消化，可以加入CuS04作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用 强酸。实验和计算方法这里从略。计算所得结果为样品总氮量，如欲求得 样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以 625 即得。 五种蛋白质测定方法比较如下：方法 灵敏度 时间 原理 干扰物质 说明 凯氏定氮法（Kjedahl法）灵敏度低，适用于0.2 I.Omg氮，误
13、差为2%费时810小时将蛋白氮转化为氨，用酸吸收后滴定非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离）用于标准蛋白质含量的准确测定；干扰少；费时太长 双缩脲法（Biuret法）灵敏度低120mg 中速2030分钟多肽键+碱性Cu2 + 紫色络合物硫酸铵；Tris 缓冲液；某些氨基酸 用于快速测定，但不太灵敏；不同蛋白质显色相似 紫外吸收法 较为灵敏50100mg快速510分钟 蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收 各种嘌吟和嘧啶；各种核苷酸用于层析柱流出液的检测；核酸的吸收可以校正Folin 酚试剂法（Lowry法）灵敏度高 5mg 慢速40 60分钟双缩脲反应；磷钼酸一磷钨酸试剂被Ty
14、r和Phe还原硫酸铵；Tris 缓冲液；甘氨酸；各种硫醇 耗费时间长；操作要严格计时；颜色深浅随不同蛋白质变化考马斯亮蓝法（Bradford法）灵敏度最高1 5mg 快速515分钟 考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时，其lmax由465nm变为595nm强碱性缓冲液；TritonX-100;SDS 最好的方法；干扰物质少；颜色稳定；颜色深浅随不同蛋白质变化二、双缩脲法（Biuret法）（一）实验原理双缩脲（NH3CONHCONH3 ）是两 个分子脲经180C左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱 性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽 键
15、，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。H2OO=C C=OHN NHR-CH CH-RO=C Cu C=OHN NHR-CH CH-RH2O紫色络合物紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质 含量。测定范围为110mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速 ，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因 此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。（二）试剂与器材1. 试剂：（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1mg/ml的A280为0.66来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微 量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H20或0.9%NaCI配制，酪蛋白用0. 05N NaOH配制。(2)双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜(CuSO45H2O)和6.0克酒石酸钾钠(KNaC4H4O64H2O),用500毫升水溶解，
