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1、Plasmid Midi Kit中量质粒提取试剂盒目录号：PL08适用范围：适用于中量高纯或者转染级质粒制备和BAC/PAC大型质粒制备 试剂盒组成、储存、稳定性：试剂盒组成保存20 次 (PL0801)40次 (PL0802)RNaseA( 10mg/ml)-20C0.75 ml1.3 ml溶液 P14C65 ml130 ml溶液 P2室温50 ml100 ml溶液pm室温50 ml110 ml杂质清除剂A室温1.5 ml3 ml杂质清除剂B室温15 ml30 ml内毒素清除剂-20C5 ml10 ml本试剂盒在室温储存 12 个月不影响使用效果。储存事项:1. 第一次使用时，将试剂盒所带全
2、部的RNase A加入溶液P1后（终浓度100Mg /ml） 置于4C保存。如果溶液P1中RNase A失活，提取的质粒可能会混杂有微量RNA 残留，在溶液P1中补加RNase A即可。2. 内毒素清除剂在4C可保存一个月，如果要长期保存，建议保存在一20C!3. 环境温度低时溶液P2中SDS可能会析出出现浑浊或者沉淀，可在37C水浴加热 几分钟，即可恢复澄清，不要剧烈摇晃，以免形成过量的泡沫。4. 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时 盖紧盖子。J o 产品介绍：本试剂盒用碱裂解法从培养菌中提取质粒DNA，采用独特的溶液配方和内毒素清 除试剂，只需要几次简
3、单离心去除蛋白质、多糖、内毒素、rna等杂质，获得高质量 的质粒DNA。纯化DNA的OD260/280通常在1.8左右，得到的质粒可直接应用于细 胞转染甚至动物体内实验等对DNA纯度要求很高的工作中。纯化后期过程均在1.5ml 小离心管中操作，方法简单，不需特殊设备，无需过柱，不用酚氯仿抽提；基本可完 全回收细菌裂解释放出的质粒,不必担心质粒DNA的丢失。本方法提取纯化质粒DNA， 对质粒损伤小，即使是10kb甚至lOOkb以上的大型质粒或超大型BAC/PAC质粒，只 要碱裂解法能够提取，就可以有效纯化。可选择任意小体积溶解质粒，浓度可高达 5賂/皿。超螺旋比例可高达95%，无内毒素，转染效果
4、好。 产品特点：1. 不需要使用有毒的苯酚，氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀。快速、 方便、从 50-70 ml大肠杆菌LB(Luria-Bertani)培养液中，可快速提取15Ogg -600gg纯净的高拷贝 质粒DNA，提取率达80-90 %。2. 获得的质粒产量高，浓度高，超螺旋比例高，纯度好，可直接用于酶切、转化、 PCR、体外转录、测序等各种分子生物学实验。3. 内毒素含量极低( 0.1 EU/gg DNA)，可直接应用于细胞转染。 注意事项1. 提取的质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。如果所提质粒为低拷贝 质粒或大于10kb的大质粒，应加大菌体使用量，同时按比例增加Pl、P2
5、、PIII 的用量。2. 提取大质粒时操作动作要轻柔，应该使用剪大了开口的吸头，防止机械剪切对 DNA 的损坏。3. DNA沉淀液沉淀离心后，可能看不到明显沉淀。如未见沉淀，担心DNA丢失， 可保留上清液，待完成全部操作后电泳鉴定，以确定是否获得终产物(数百微克 DNA 离心沉淀在管的侧壁上，可能无法看到明显团块)。4. 得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度oOD260 值为1相当于大约50gg/ml DNA。电泳可能为单一条带，也可能为2条或者多条 DNA 条带，这主要是不同程度的超螺旋构象质粒泳动位置不一造成，与提取物培 养时间长短、提取时操作剧烈程度等有关。本
6、公司产品正常操作情况下基本超螺 旋可以超过 95%。5. 质粒DNA确切分子大小，必须酶切线性化后，对比DNA分子量Marker才可以 知道。处于环状或者超螺旋状态的质粒，泳动位置不确定，无法通过电泳知道确 切大小。 操作步骤：（实验前请先阅读注意事项）O 提示：将RNase A全部加入溶液P1中，混匀，使用后置于2-8C保存。1. 取过夜培养菌40-60ml（最大不超过90 ml）菌液，装入50ml离心管中，4,5006,000x g于4C离心5 min沉淀菌体（也可12,000 x g离心2分钟），完全弃除上清。2. 加入2.5 ml溶液P1,充分混悬震荡菌体沉淀，使其完全分散开，至无絮块
7、存在。 室温放置 35 min。如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。3. 加入2.5 ml溶液P2,轻轻颠倒离心管68次，室温放置5 min,使细菌完全裂解， 溶液透明。温和地混合，不要剧烈震荡，以免基因组DNA剪切断裂！所用时不应超过5分钟！以免质粒受到破坏。此时菌液应变得清亮粘稠，如果菌体少，很快清亮粘稠后就可以做下一步，不是一定要准确的5分钟。如果未变得清亮，可能由于菌体 过多，裂解不彻底，应减少菌体量。4. 加2.5 ml溶液PIII，立即颠倒离心管68次，充分混匀，至白色絮状物产生。上 述裂解液于4C 12,00016,000 x g离心1015 min，小心吸
8、出上清，移入新的50 ml 离心管中。加入溶液PM后应该立即混匀，以免产生SDS的局部沉淀。注意： 使用异丙醇沉淀，蛋白杂质和盐离子共沉淀较少，可能看不到明显的较 大团块沉淀，但是质粒还是可以完全沉淀下来，不影响实际的质粒产量。如果你 习惯看见较大的沉淀团块操作，可以选择 2倍体积的无水乙醇沉淀。5. 加入 5 ml 异丙醇，颠倒离心管，充分混匀。6. 于4C 12,00016,000 x g离心10 min，小心弃去上清，倒置于吸水纸上轻轻沥干 残余液体，加入 3-5ml 70%乙醇漂洗一遍，最高速离心 5 分钟，弃上清，晾干沉 淀。DNA沉淀如果干燥过头，DNA将无法完全溶解，但是如果乙醇
9、没有晾干挥发干 净，残留太多，也会造成DNA无法完全溶解。注意：异丙醇离心沉淀后，质粒纯度很高吸附在管底和侧壁可能看不见沉淀，但是不影响产量，后续步骤仔细吹打管底和沉淀所在的侧壁涮洗溶解质粒。7. 加入 0.7 ml 溶液 P1 完全溶解沉淀团块，注意附着在管底和侧壁上的质粒沉淀虽 然可能看不见，也要吹打管底和沉淀所在的侧壁涮洗下来（大质粒可用宽口吸管 轻轻吹打辅助溶解）。然后将质粒溶液转入 1 个新的 1.5 ml 离心管中。 可选步骤（一般不需要）：如果菌株 RNA 丰富有微量 RNA 残留，可在此步骤后 将质粒溶液60C孵育15 min消化RNA。8. 加入55皿杂质清除液A,颠倒充分混
10、匀后加入约0.1体积（约80pl）冰预冷的内毒 素清除剂，颠倒旋转7-10次（30秒左右）充分混匀，冰浴或者冰上放置=5分钟， 中间偶尔颠倒混匀几次。内毒素清除剂加入上清后,上清会变得浑浊,但是冰浴后应恢复清亮。注意：如果不需要去内毒素用于转染，可在此步骤只加入55皿杂质清除液A,充 分混匀后冰上放置5分钟,离心后小心取上清转入一个新管,直接接步骤11。9. 42C水浴，溶液又会变为浑浊，颠倒混匀后42C温育5分钟。10. 室温 14,000 x g 离心 5 min 分相（温度低时，内毒素清除剂无法分相，因此必须 至少20C以上室温离心或者保证冬季转头温度20C以上）。上层水相含DNA,下
11、层蓝色油状相含内毒素和其它杂质。将含DNA的上层水相转移到新管（注意不 要吸到蓝色油状层，里面含内毒素等杂质），弃油状层。溶液必须分为上下两相，否则应重复步骤 9-10。11. 将上一步所得上层水相中加入等体积杂质清除液B （约750皿），轻柔混匀，4C 14,000 x g离心10 min，弃上清（注意不要丢失DNA），轻轻加入1 ml 70%乙醇 洗涤，离心弃上清，共两次，室温倒置晾干510 min使乙醇完全挥发。12. 加适量TE或者纯水（50100皿）溶解沉淀（可在37C水浴中振荡以辅助溶解）。 要注意很多质粒 DNA 可能附着在离心管侧壁上，即使看不见，也应该充分吹打 侧壁溶解回收质粒 DNA。最后沉淀可以根据需要选择任意小体积溶解，这样可以得到很高浓度的转染级质 粒DNA （高达5-10咖）。如果有需要，客户也可以选择更大体积溶解。
