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1、光学显微镜的原理及构造显微镜是人类认识物质微观世界的重要工具，是现代科学研究工作不可缺少的仪器之 一。显微镜自1666年问世以来已有300多年的历史了，其间随着科学技术不断发展，显微 镜的品种不断增加，结构和性能逐步得到完善和提高。根据不同的使用用途，光学显微镜 可分为普通光学显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、荧光显微镜、倒置显微镜、体视显微 镜、偏光显微镜等10多种。目前，世界上许多国家都可以生产光学显微镜，牌名、种类繁 杂，其中德国、日本等国制造的显微镜品质、数量占优势，但价格昂贵。对于现代的光学 显微镜，包括各种简单的常规检验用显微镜、万能研究以及万能照相显微镜等，首先要认识 其构造及各
2、部件的功能，同时要掌握正确的调试、使用和保养方法，才能在实际应用中面对 各种要求时以不同的显微镜检方法，充分发挥显微镜应有的功能，提高常规检验工作效率.光学显微镜的原理和构造随着科学技术的发展，显微镜检方法由最传统的明视野、暗视野发展出了相差法、偏光 方法；荧光方法也由透射光激发进展为落射光激发，使荧光效率大为提高；微分干涉相衬方 法基于偏光方法，而巧妙地利用了微分干涉棱镜，使之能应用于医学与生物学的样品，又能 应用于金相样品的分析与检验。下面以德国ZEISS公司生产的Axioplan万能研究用显微镜，简单介绍万能显微镜的基 本组成部件。1. 显微镜主机体(stand)显微镜的主机体设计成金字
3、塔形，而底座的截面呈T字形，使显微镜的整体相当稳固。显微镜的光学部件和机构调节部件、光源的灯室、显微照相装置、 电源变压稳压器等，都可安装在主机体上或主机体内。2. 显微镜的底座(base) 底座和主机体通常组成一个稳固的整体。底座内通常装有透射 光照明光路系统(聚光、集光和反光)部件，光源的滤光片组，粗/微调焦机构，光源的视 场光阑也安装在底座上。3. 透射光光源(tranilluminator) 透射光光源由灯室(lamp housing)、灯座(lamp socket)、卤素灯(halogen lamp)、集光与聚光系统(lampcollector and lamp condenser)
4、 及其调整装置组成。4. 透射光光源与反射光光源的转换开关(toggle switch) 这是新一代AXI0系列显微镜 特有的装置，透射光和反射光可通用。当具有透/反两用的配置时，利用这一转换开关能方 便而又迅速的使透射光和反射光互相转换。在纯透射光的配置中，这一开关就改为电源开 关。5. 电源开关(mains switch)与亮度调节旋钮(brightness control) 电源开关用来接 通或切断显微镜所需用的交流电源。电源开关旋钮也可调节照明光源的亮度，使所观察的视 域可随时获得适当的亮度，可调范围为3-12V。作显微照相时，可根据曝光以及彩色底片 色温的要求来调节灯光的亮度。当准备
5、关掉电源之前，应先将亮度调节旋钮调到最小。6. 粗、微调焦旋钮(coaxial coarse/fine focusing controls) 调焦旋钮转动时带动 燕尾导板上下移动，而导板上则装有物台托架和聚光镜托架，从而使物台趋向或远离物镜达 到调焦的效果。7. 透射光用的滤光片选择按钮(push buttons for filter magazine) 透射光显微镜检 方法所需用的一组滤光片已安装在显微镜的底座内，通过底座外的按钮就可以根据不同的需 要来选择适用的一块或一组滤光片。通常的滤光片配套有：(1) 蓝色色温转换滤光片：用来把光源的色温由3200K转换成日光型彩色底片所需的5500K
6、 色温；(2) 绿色滤光片：用来增强相差观察方法中成像的反差，或者以黑白底片作显微照相时，可 以提高片成像的反差；(3) 浅灰色滤光片：是透光率为50%的中性减光滤光片，可把视野的亮度减弱一半；(4) 灰色滤光片：是透光率为25%的中性减光滤光片，可把视野的高度减弱75%；(5) 透光率仅为6%的中性减光滤光片，可把视野的亮度变得相当暗，95%以上的光都已被吸 收掉。&光源的视场光阑(luminuos field diaphragm) 视场光阑是显微镜照明光路系统中的 重要部件之一，它只能按照库勒照明系统的要求来进行调节，视场光阑不可以任意开大，但 要根据使用的物镜倍数来调节适当的大小。视场光
7、阑的主要功用有：(1) 控制杂散光在成像光路系统中的影响，特别是免除杂散光对照相系统的干扰，使显微照 相的底片不至于蒙上一层灰雾；(2) 控制照明光束的大小，使所观察的视域能受到均匀的照明；(3) 在荧光显微镜检方法中，可以把激发光限制在所需激发样品的视域范围内，以防止视域 外的样品过早受到激发。9.聚光镜系统(condenser system) 聚光镜系统是照明光路系统中的重要部件之一，它 也只能按照库勒照明系统的调整要求来进行调节。聚光镜系统调整的好坏，可以直接影响显 微镜视域中照明的均匀性，也可影响显微镜的分辨力，还可以直接控制显微照相底片上的 反差。聚光镜系统通常由以下几个部件组成：(
8、1) 聚光镜本体(condenser) 可以是简单的阿贝聚光镜，也可以是消球差-消色差的优质 聚光镜，另外还有一种是消除了内应力的偏光聚光镜。聚光镜的重要参数之一是数值孔径(NA)，通常为0.32；这样的数值孔径太小，只能与以下的物镜配合使用，因此需配用前 端透镜来提高数值孔径，以便与不同倍数的物镜灵活配合使用；(2) 前端透镜(frontlens)前端透镜本身的数值孔径通常为0.63、0.90、1.30或1.40,它要附装在聚光镜本体上，可以方便地摆进或摆出光路。最常用的前端透镜数值孔径为 0.90，当它摆入光路时，可以和10X及以上的物镜配用，摆出光路时可以和10X以下的物 镜如6.3X.
9、5X及2.5X等物镜配用；(3) 聚光镜的孔径光阑(aperture diaphragm) 孔径光阑实际上是一个可变光圈，它是显 微镜照明光路系统中的又一个重要部件，在透射光明视野法、微分干涉相衬法以及偏光法所 使用的聚光镜中，都装有孔径光阑。它可以影响显微镜在作观察时的分辨力；直接控制显微 照相底片上的反差；可用来调节聚光镜的数值孔径，配合所用物镜的数值孔径，以取得最 佳的分辨本领，或最大的分辨本领；还可以使光源的发光体成像于孔径光阑所在的平面上 从而满足库勒照明系统的前提条件。在实际操作中，调节聚光镜孔径光阑可以改变显微镜中所观察到的视野亮度，这是由于 历史上对聚光镜孔径光阑的误解所造成的
10、错误用法。这里要特别强调：不应该用聚光镜的孔 径光阑来调节视野中的亮度、更不应该用调节聚光镜位置高低的方法来调节视野中的亮度！ 以往的错误用法希望能在实际操作中纠正过来。(4) 转盘(turret) 在多用途聚光镜系统中，为方便才把明视野的孔径光阑、暗视野的中 央光挡、相差法所需用的各种不同直径的环状光圈、微分干涉相衬法用的DIC棱镜及其孔 经光阑等部件装在转盘上再嵌入到聚光镜本体的座子内，使用时转动转盘就可以选用不同显 微镜检法所适用的聚光镜，方便而又快捷。聚光镜系统有两个调节装置：a. 聚光镜的调中螺丝(centering screws) 调中螺丝通常为1对，位于聚光镜托架 前方的左右测。
11、和环形燕尾槽中的调中螺丝成三足鼎立之势，可以聚光镜前后、左右调整， 使聚光镜的光轴与照明光路、成像光路合轴；b. 聚光镜托架的上下调节装置(ver tical adjus tment of condensercarrier)： 利 用这个调节装置，可使聚光镜的位置作上下调动，使视场光阑经过聚光镜在样品视野中的成 像调到最为清晰，光阑像的位置也可利用托架上的调中螺丝来进行调中，从而满足库勒照 明系统调整的要求。10. 机械移动式载物台(specimen st age) 载物台可以承载样品，装有可在水平方向上 作前后、左右移动的调节装置，有的还可以在水平方向上作大约100度的旋转，以便使样品 能更
12、好地与显微照相的取景框相适配。11. 物镜转换器(nosepiece) 物镜转换器安装在滑插式燕尾槽座上，已作了准确的对中。 可迅速更换物镜。常用的有6个、5个及4个孔位的物镜转换器。12. 物镜(objectives) 物镜是显微镜的核心光学部件，显微镜的放大倍数、分辨本领、 色差与像差的校正状况、工作距离等，都有直接由物镜来决定。衡量物镜质量的基本参数主 要有：a.色差消正的程度(或级别)；b.像场平坦的程度；c.所使用的玻璃材料。数值 孔径(NA)是物镜最重要的参数，数值孔径越大，分辨率越高。目前物镜的数值孔径最大只 有1.30。按照物镜色差和像差校正的程度，物镜可以分为以下类别：(1)
13、 消色差物镜(achomats) 通常对红光与蓝光两种色光作了色差校正，但视域中像场的 平坦程度并未作过完善的校正，因此只能作一般的观察应用。在偏光显微镜中，由于需要消 除物镜内各个镜片的内应力，反而需要利用这种镜片数目不多的物镜来做偏光物镜。(2) 有限平像场消色差物镜(flat-field achromats) 这也是对两种色光作了校正的消色 差物镜，但视域范围内像场的平坦程度只作了有限范围内的校正，通常在显微照相取景框范 围内像场是平坦的，以确保显微照相对焦的清晰，取景框范围以外，往往不一定能保证同样 的清晰度。适用于常规检验而又需要作显微照相的工作中。(3) 完善平像场消色差物镜(pl
14、an-achromats)这也是对两种色光作了校正的高级消色差 物镜，主要特点是像场在整个视域中作了完善的校正，适合于作要求较高的显微镜检工作， 特别是作显微照相效果更好。由于这种物镜仍采用常用的光学玻璃，不适宜作荧光等这一类 弱光的观察和照相。(4) 萤石玻璃消色差物镜(neofluar) 这也是对两种色光作了色差校正的消色差物镜，其 中全部或部分镜片则采用了可透过近紫外光(波长约为365nm)的萤石玻璃(即氟化钙晶体) 来制造。因此特别适合于作荧光与相差方法的观察与显微照相，也可用在偏光显微镜中。(5) 完善平像场复消色差物镜(plan-opo-chromats) 这是最高一级的消色差物镜
15、，对红、 绿、蓝3种颜色都作了很好的色差校正，而视域中的像也作了完善的校正，数值孔径比萤 石物镜大，可应用于要求极高的显微观察与显微照相中，但价格十分昂贵，由于所使用的镜 片数目多达12片，光能损失较大，不宜用作荧光观察与照相。(6) 已消除内应力又可以调节中心的物镜(pol Z objectives) 这是一种适用于作偏光观 察的物镜，是从以上所介绍的几种物镜中挑选出来的，在装配时特别注意消除了其中的内应 力，以免内应力所引起的干涉条纹干扰了偏光样品中真正的干涉条纹。(7) 完善平像场萤石消色差多种介质浸没式物镜( plan-neofluar imm.) 这是一种新型 物镜，采用萤石玻璃制造
16、其中全部或部分镜片，成像质量特别明亮，反差十分好，色差接近 于复消色差，因此又属于半复消色差物镜。数值孔径特别大，透光能力强，而且分辨率十分 好。最大的特点是可用好几种浸没介质，如常用的浸没油、甘油、蒸馏水等，既可使用权盖 玻片也可以不使用。这种物镜制成干式物镜时，可加上校正环，用来校正盖玻片的厚度不均 匀性，以消除盖玻片厚度不规则造成的成像失真，对于厚度在0.12-0.22mm之间的盖玻片都 可以作相应的校正。1986年以来，德国蔡司公司推出的新一代光学显微镜，其中的物镜突破了传统光学显 微镜的概念，采用了无限远色差校正的光学系统(infinity color-corrected system，简 称ICS物镜)，其特点是：由物镜射出的成像光束是一束平行光，可在成像光路中按需要插 入任意多的光学部件而不影响成像质量。在显微镜镜 体内有一特制的镜筒透镜(tube lens) 与物镜相配，两者结合起来把物镜的色差与
