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1、华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书学位沦文刁如需保密，解密时间年月日是否保密侈独创性声明本人声明所星交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致i射的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行7审定。与我一NT作的同志对本研究所做的任 何奉献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。研究生始焱鲁帆训，年6月2；日撇：泌彳靳躲一签名日期：2。11年5 FJ二；日签名日期：弘11年6月2弓日甘蓝型油菜硼转运子基因的克隆、表达和分子进化日习摘
2、要IABSTRACTIII缩略语表VIAbbreviatiOilVI1前言111引言112文献综述1121土壤和植物中的硼。21211土壤中硼的分布和分类21212我国土壤中硼的现状21213硼在植物中的分布3122硼在植物中的生理功能一31221硼与细胞壁41222硼与细胞膜51223硼与碳水化合物51224硼与激素61225硼与酚类61226硼与生殖发育7123硼在植物体中的转运71231硼的被动吸收71232硼与糖的共运输812-33水通道介导的硼转运91233转运子介导的硼转运10124植物硼营养高效的研究121241植物硼营养效率的基因型差异121242植物硼营养高效的机制12124
3、3甘蓝型油菜硼高效的研究。132本研究的目的和意义一1521研究意义1 522研究内容1 523研究目标1 624技术路线。163硼高、低效品种的性状考察1731材料与方法17311植物材料和培养方法17312营养液培养试验的设计17313生理指标和硼浓度的测定方法18314数据处理和统计分析1 832结果与分析18321硼对甘蓝型油菜硼高、低效品种干重和根长的影响18322不同硼水平下，甘蓝型油菜硼高、低效硼累积和转运能力的差异2133讨论234甘蓝型油菜BnBORl基因的克隆和分子进化24华中农业大学2021届博士研究生学位论文41材料和试剂24411植物材料24412菌株24413试剂和
4、试剂盒244131核酸提取以及检测试剂244132基因克隆试剂及试剂盒254133 Southern杂交试剂及试剂盒2642实验方法和步骤27421植物材料的处理27422核酸的提取274221基因组DNA的提取274222基因克隆的总RNA的提取284223总RNA中DNA的去除294224 DNA和RNA浓度的测定和质量检验29423基因克隆。314231逆转录RACE第一链eDNA合成3l4232 5一和Y-RACE324233甘蓝型油菜BOR基因全长的别离344234 BnBORl1a上游序列的别离354235甘蓝型油菜BOR基因PCR产物的连接转化和测序37424分子进化分析4142
5、41甘蓝型油菜BOR家族的Southern杂交分析414242核酸和蛋白质序列结构和功能的生物信息学分析4543结果与分析50431总DNA和RNA的提取50432甘蓝型油菜硼转运子基因的克隆514321 RNA逆转录成eDNA514322甘蓝型油菜BOR基因3一和5-RACE末端克隆514323甘蓝型油菜BOR基因全长eDNA和基因组序列的克隆534324砌BDRJjJ口上游序列的克隆一54433分子进化分析554331 Southern杂交鉴定甘蓝型油菜BOR基因数目554332芸薹族BORl基因核酸序列的特点574333 BnBORl基因蛋白质序列的分析604334芸薹族BORl基因的分
6、子进化特征6944讨论77441基因家族成员的一些结构特征77442密码子和进化特征78443基因家族的进化关系795甘蓝型油菜硼转运子基因的表达和定位8251材料和方法82511材料和试剂825111植物材料825112试剂和试剂盒82甘蓝型油菜硼转运子基因的克隆、表达和分子进化512实验方法和步骤835121植物材料的处理835122核酸的提取。835123 BnBORl的表达分析855124硼转运子基因的定位。8952结果与分析92521 RNA的质量92521表达分析925211苗期缺硼诱导表达925212组织特异性表达93522硼转运子基因在遗传连锁图谱上的定位945221硼转运子基
7、因定位。945222硼转运子基因与硼相关QTLs9553讨论986总结与展望。10061总结1 0062本研究的主要创新点10163本研究的缺乏之处10264下一步的工作103参考文献一1 04至j谢1 1 6附ji乏1 1 7甘蓝型油菜硼转运子基因的克隆、表达和分子进化摘要硼是植物生长发育必需的微量营养元素之一。油菜在我国是继水稻、小麦、玉 米、大豆之后的第五大作物，是我国的主要油料作物之一。甘蓝型油菜是需硼较多 的作物，对缺硼敏感。缺硼影响营养生长和生殖生长，导致甘蓝型油菜植株矮小， tc花而不实，从而造成产量的大量减产。在我国，油菜的主产区位于长江中下游， 其总产量占全国的80以上，而这
8、一地区的土壤普遍缺硼。不同甘蓝型油菜品种的 硼吸收利用效率存在显著差异，而且受基因控制，这为硼效率性状的遗传改进提供 了根底。硼转运子广泛存在于高等植物中，负责硼在植物体内的转运，在植物缺硼 胁迫和高硼毒害时发挥重要的作用。我们课题组在筛选获得甘蓝型油菜硼高效和低 效品种的根底上，已经开展了硼高效的生理机制和硼高效QTLs的研究。为了明确 甘蓝型油菜中硼转运子与硼高效吸收转运的关系，本文研究了硼高、低效品种苗期 硼吸收转运的差异，在甘蓝型油菜中克隆了硼转运子基因BnBORl，分析了这些基 因的分子进化和表达模式，探讨了硼转运子基因与硼相关QTLs之间关系。获得以 下主要结果：1不同硼处理下，甘
9、蓝型油菜硼高、低效品种的生理差异 营养液培养条件下，调查了硼高效品种青油lO号和硼低效品种Westar在不同硼水平下的干重、根长、硼累积量和硼转运系数。结果说明，在缺硼(O25 pM)条件下，硼高效品种(青油10号)生长较好，而硼低效品种(Westar)对缺硼敏感，生 长明显受阻。硼高效品种的硼转运系数(地上部和根部硼累积量的比值)高于硼低 效品种，即硼高效品种具有较高的硼转运能力。 2硼转运子基因的克隆及其结构特征利用同源克隆法，采用RACE技术，在甘蓝型油菜中别离克隆了6个硼转运子 基因，分别命名为：BnBORl；la、BnBORl；lc、BnBORl；2a、BnBORl；2c、 BnBO
10、Rl；3a和BnBORl；3c。Southern杂交和基因克隆的结果说明，甘蓝型油菜 BnBORl基因家族很可能仅存在6个BnBORl基因。BnBORl存在内含子保存和竞争性剪切的方式，在其3端还存在丰富的可变加 尾位点。BnBORl；la在转录起始位点TATA box和5端非翻译区之间有一个33 bp 的反向重复序列，这可能是一个芸薹族特异的新近产生的MITE-like结构。 BnBORl；la、BnBORl；lc、BnBORl；2a和BnBORl；2c丧失了两个内含子。 3硼转运子基因的分子进化对芸薹科BORl基因系统进化树分析说明，甘蓝型油菜BnBORl为拟南芥 AtBORl的直系同源基
11、因，它们一起形成芸薹科BORl基因家族。6个BnBORl基因 可分为3个组，每组包括2个基因，一个来源于A基因组，另一个来源于C基因华中农业大学20il届博士研究生学位论文组。其中，BnBORl；la和BnBORl；lc为第一组(Group I)；BnBORl；2a和 砌曰ORl；2c为第二组(Group II)；BnBORl；3a和BnBORl；3c为第三组(Grouplll)， 并且，第一组和第二组的亲缘关系比它们与第三组的亲缘关系更近。其中， BnBORl；Ia、BnBORl；2a和BnBORl；3a来自于A基因组，另外3个基因来自于C 基因组。6个BnBORl基因的系统进化树证实了芸薹
12、族物种三倍化和甘蓝型油菜的 异源二倍化理论，说明BnBORl基因的形成反映了芸薹族基因组进化过程中的三倍 化事件。在此根底上，我们提出假说，认为芸薹族的三倍化不是一次加倍过程形成 的，而是由一个同源四倍化和一个异源二倍化两个过程综合作用的结果。BnBORl密码子存在一定的偏爱性，但成员之间差异不显著。基因编码序列的 KaKs值为0024900978，远小于1，说明在基因进化过程中受到了强烈的纯化选 择。用PAML 44中M8模型的BEB分析BnBORl，检测到了6个可能受正向选择 的氨基酸位点，其中L7位点的概率到达了显著水平。另外，M2(双速率)和M0 (单速率)模型检测到BnBORl；3a
13、和BnBORl；3c受到相对较小的选择压力。 4硼转运子基因的表达Northern杂交结果说明，在甘蓝型油菜的苗期，BnBORl主要在根部表达；与 拟南芥AtBORl的转录水平不受硼诱导不同，其在根部明显受缺硼诱导上升表达。 大田试验中，用半定量RT-PCR方法检测硼高效品种青油10和硼低效品种Westar 不同器官在硼正常和缺硼条件下BnBORl基因的表达。研究发现，BnBORl基因家 族成员的表达存在组织特异性的分化。BnBORl；3a和BnBORl；3c在所有的部位 (根、茎、叶、花、蕾和长角果)都检测到表达，而其余四个基因仅在根、茎和花 中有一定的表达。在缺硼条件下，BnBORl；lc、BnBORl；2a和BnBORl；2c的表达受 缺硼诱导显著的上升。硼高效品种青油10号和硼低效品种Westar之间，BnBORl 基因表达存在明显的差异。无论在正常还是缺硼条件下，BnBORl；lc在硼高效品种 QYIO中的表达都要显著的高于硼低效品种Westar。在甘蓝型油菜的花中，硼高效 品种QYlO所有BnBORl基因的表达要明显的高于硼低效品种Westar。 5硼转运子基因在甘蓝型油菜遗传连锁图谱上的定位在甘蓝型油菜TN遗传连锁图谱上定位两个硼转运子基因BnBOR2-A和 BnBOR7-A。BnBO
