食药用菌多糖结构解析中的核磁共振技术

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1、食药用菌多糖结构解析中的核磁共振技术摘要：核磁共振(N uclear magnetic resonance, NMR)技术的发展，特别是高 场核磁共振技术和脉冲-傅立叶核磁共振(Pulse and Fourier Transform nuclear magnetic resonance, FPT-NMR)技术的出现，为核磁共振技术在多糖结构解析中 的应用提供了广阔的前景。本文较详细地综述了核磁共振常用脉冲及新脉冲序列 在多糖结构解析中的应用，并探讨了核磁共振模拟测序软件在多糖结构解析中的 应用前景。关键词：核磁共振(NMR)；结构解析；多糖；二维核磁共振(2D NMR)自1945年,以F.Bl

2、och和E.M.Purcell为首的两个小组观察到核磁共振(N uclear magnetic resonance, NMR)现象以来，核磁共振波谱学技术发展迅速。目前，核 磁共振技术已在有机化学、生物化学、临床医学、药物化学、物理化学和无机化 学等多个学科领域得到了广泛的应用1,并已成为有机化合物结构鉴定及化学 动力学等研究中最重要的一种方法。牛津大学的DWEK教授(1988年)发表 的以“糖生物学”为题的综述，标志着以多糖类大分子结构为基础的糖生物学研究 的开始。而多糖结构的微观不均一性、高组合性(3个核昔酸组成的核酸结构最 多只有6种，而由3个不同单糖残基组成的三聚寡糖的结构高达2764

3、8种)3、 表达的非基因控制性和分析手段的局限性(以往的化学手段或质谱技术只能简单 地描述多糖的单糖组成种类及残基类型，已有的自动测序仪也只能测序由8个单 糖组成的寡糖)4, 5，一直制约着多糖研究的快速发展。从上世纪70年代，随着核磁共振技术、特别是高场核磁共振技术和脉冲-傅立 叶核磁共振(Pulse and Fourier Transform nuclear magnetic resonance， FPT-NMR) 技术引入多糖研究领域,使多糖结构解析所需时间越来越短。食药用菌多糖作 为生物多糖中的一个分支，核磁共振技术在食药用菌多糖研究中的应用又较细菌 多糖及其它真菌多糖的晚10年左右7

4、。Science-direct数据库的资料显示，到2006 年为止，使用NMR技术阐述多糖结构的报道达2670多篇，其中阐述食药用菌 多糖结构的报道只有96篇，而仅2006年，使用NMR技术报道食药用菌多糖结 构的文献就达22篇，占所有报道食药用菌多糖结构文章的23%，表明利用NMR 技术解析食药用菌多糖结构正呈现快速发展的趋势。由于对食药用菌多糖结构的不了解，因此对其活性多糖的开发一直没有重大 的突破，多糖产品也多以粗加工为主。本文着重阐述了核磁共振常用技术在多糖 结构解析中的应用，旨在为食药用菌多糖结构与活性的分析提供一定的参考。1 一维核磁共振(One-dimensional NMR s

5、pectra, 1D NMR)技术在多糖结构 解析中的应用1.11H NMR 谱在1H NMR谱中，多糖的化学位移大多集中在63.54.48, 12,而64.45.8(异 头质子区)共振峰是结构分析的突破口，反映糖残基构型，一般吡喃型糖残基的a 构型异头氢的65.0, P构型的65.09。结合异头氢和邻位氢的偶合常数J 1,2 也能对异头氢的构型进行判断，在a构型糖残基中1位和2位碳上的氢为ae型， 而在卩构型中两个氢为aa型，根据Karplus公式，卩构型为J 1,2=79Hz，a 构型为J 1,2=24Hz10。在甘露型11吡喃糖残基中C 2-H为平伏健(e健) 时，无论是a构型还是卩构型

6、，两个氢均为ae型，因此不能以此判断其构型；同 时，异头质子区内也可能有C2C6位置乙酰化质子的信号。咲喃糖异头碳的氢 化学位移为65.4左右，J 1,22Hz，这是咲喃糖环区别吡喃糖环的主要特征13。 还有一些质子信号如岩藻糖C6位上的氢，其6在1.11.3之间13； 62.00附近 的质子信号，其可能是乙酰化糖结构中乙酰基中甲基氢或氨基糖中于N-乙酰氨 基中的甲基氢14，此类信号的出现有助于判断单糖残基种类。1.213C NMR 谱通常所述的13C NMR谱指的是用全去耦(Decoupling)方法得到的碳谱， 在去耦的同时，由于发生Overhauser效应(Nuclear Overhau

7、ser effect, NOE)，峰高 不能定量地反映碳原子数量，但采用特殊的脉冲序列如抑制NOE的门控去耦谱 (Gated decoupling with suppressed NOE)，谱中谱线的高度和碳原子的量成正比， 在13C NMR谱中最重要的信息是化学位移。13C NMR谱在多糖结构解析中主 要解决以下几个问题：确定糖残基的构型。通常，a构型的化学位移为690 102,卩构型的化学位移为610211215-17；但甘露糖和鼠李糖不能以此作判断, 可根据1J C,H大小判断其构型，J C,H=170Hz可判断为a构型，J C-H160Hz可归属为卩构型，此规律只适合于吡喃型糖。确定糖

8、残基的取 代点。当糖残基上某个位置被另外的糖残基取代时，a位的碳明显地移向低场， 卩位的碳向高场有较小幅度地移动，可以此来判断糖链的分枝点。一般情况下， 在吡喃型糖残基中，未被取代部位(C2、C3、C4)的碳的共振区为67075,若 发生取代则该碳的化学位移将移至67685；如C-6位被取代，则其化学位移将 从662转至667附近18。确定单糖的种类。谱图中,除一些常规的峰组外，有 时还会在特殊位置出现一些信号，这对多糖中单糖残基种类的确定很有帮助。例 如，在650.852.2范围内的信号提示有GalN残基的存在；6170176范围内的 低场信号表明该单糖残基为已糖酸或有乙酰氨基存在；623.

9、523.9范围内的信 号表明有氨基存在14； 61618范围内的信号则为C-6脱氧糖甲基碳的信号 19； 659.4位置的信号峰表明有甲基氧的存在20。2二维核磁共振(Two-dimensional NMR spectra, 2D NMR)技术在多糖结构 解析中的应用2.1C0SY相关谱(Correlated spectroscopy,COSY)是二维谱中最简单也是最常用的实验 技术，从异头氢出发，通过邻近氢原子的耦合关系确定氢原子之间的连接关系。 在COSY-90呻，由于谱图较复杂,无法区别同碳氢耦合(2J H,H)和异碳氢耦合(3J H,H)，但可以使用COSY-45。来区分。在COSY-

10、45。中，同碳氢耦合和异 碳氢耦合的峰组形状发生了改变21。异碳氢耦合峰组的重心连线与对角线相互 垂直,而同碳氢耦合峰组的重心连线与对角线大致平行。此外，为了提高分辩率, 可以采用双量子相关谱(Double-quantum COSY, DQF-COSY)，因为在 DQF-COSY中，溶剂峰和强峰都受到一定程度的抑制，而且对角峰和交叉峰均为 吸收型峰；DQF-COSY的灵敏度不如COSY,但其解谱规则与COSY相同。特别 需要注意的是，当J H,H很小时，在COSY中不出现交叉峰，如半乳糖的J 3,4=3Hz,只能从HlfH2H3,此时，须借助其它方法如DQF-COSY、总相 关谱(Total

11、correlated spectroscopy, TOCSY)和大的偶合常数 J 2,38Hz 对各氢 进行归属22。2.2TOCSY总相关谱描述的是同一自旋体系中所有氢原子之间标量耦合的相关性。图1 为CHAKRABORTY(2002)等报道的多糖AQS-I的TOCSY谱23，图中A为 4)-a-D-Glcp-(lf残基中的所有有耦合作用的氢原子自旋体系，B为 6)-D-Glcp-(l残基中的氢原子自旋体系。以B为例，在图谱中从异头氢B1 作垂直线，可以发现处于同一自旋体系中的所有氢原子(B2、B3、B4、B5、B6、 B6)均在B1的垂直线上；但必须注意到，不是所有己糖都有一个完整的自旋体

12、 系，自旋体系形成的前提是必需要有足够大相邻氢原子的偶合常数。在多糖解析 中，因葡萄糖构型(葡萄糖和异鼠李糖)的J 2,3、J 3,4和J 4,5在810Hz 之间24，才有图1所示的自旋体系；由于J 3,4和J 4,5较小，阻碍了从H1 H6 的相关传递，自旋体系中断，由此可以推断半乳糖构型的存在25,在TOCSY 中, 只能从 H1H3，此时，我们可 以借助 NOESY(Nuclear Overhauser effect spectroscopy)中H3、H4、H5较强的偶极偶合来对各原子进行归属。Astraetis hygro/netricus2.3NOESY 和 ROESYNOESY是

13、通过空间的偶极-偶极(Dipole-dipole)偶合来提供同一多糖残基内 或不同多糖残基之间结构信息的一种脉冲序列。NOESY的图形与COSY和 TOCSY的相似，但NOESY除表现COSY中的核组外，还表现交叉弛豫(Crossing relaxation)的核组。所以在分析NOESY时,要除去COSY中的核组，余下的核组 表示的是交叉弛豫的相关峰。在使用NOESY的同时，可结合使用 ROESY(Rotating frame Overhauser effect spectroscopy)脉冲，这样可以区分溶剂交 换弛豫和偶极-偶极弛豫所形成的相关峰。在ROESY中，两种弛豫过程中产生 的交叉

14、峰的信号不同，这样可从中辨别活泼氢原子，而在NOESY中信号无区别 26。ROESY的另外一个优点是，它只显示空间偶合或溶剂交换形成的相关峰， 而不显示COSY的相关峰，简化了图谱，有利于分析，特别是当多糖分子中有 活泼氢(如-NH2,-NAc)时，最好使用ROESY。2.4HMQC (HSQC)和 HMBC(检测 1H)的异核多量子相干(lH-detected) heteronuclear multiple-quantum coherence, HMQC是近年来发展起来的实验技术，其功能相当于13C-1H COSY， 只是其是通过检测1H的信号而间接检测13C的信号的一种方法，增加了灵敏度;

15、 谱图与13C-1H COSY相反,F1域为13C核的化学位移，而F2域为1H的化学位 移。在多糖的结构解析过程中，首先用COSY谱对糖环中的氢原子进行归属， 然后结合HMQC谱对碳原子位移进行归属27, 28。(检测1H)的异核体单量子 相干(1H-detected) heteronuclear single-quantum coherence, HSQC 的图谱和 HMQC完全一样，但是在F1维的分辨率比HMQC高。从目前文献报道来看，HMQC比HSQC的应用更广泛，这让人很难理解，可能是HMQC较HSQC早出 现的原因。(检测 1H)的异核多键相关(lH-detected) hetero

16、nuclear multiple-bond correlation, HMBC谱给出的信息与长程耦合13C-1HCOSY相似，只是F1维与 F2维的信号刚好相反。在多糖的解析中，其作用是可跨过氧原子或季碳将邻近单糖残基连接起来，反映的是3J H-C-O-C和3J H-C-C-C22, 29。3 NMR新技术在多糖结构解析中的应用3.1NMR新脉冲序列和杂交技术在多糖结构解析中的应用到目前为止，因为多糖的快速弛豫、13C低天然丰度(Bundance)和核磁共 振对样品纯度的严格要求，很大程度上限制了多糖结构解析方法的发展，科学家 们一直在寻找和探索灵敏度更高、对样品要求不是很严格、快速而简洁的NMR 脉冲序列和分析方法。SZYMANSKI证实，用整细胞高分辨率魔角旋转核磁共振 (High res