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1、 重组抗菌肽的特性：溶解性，抗菌性，影响抗菌肽活性的因素摘要： 菌丝霉素是第一个被发现的真菌防御素，具有强的抗革兰氏阳性菌活性。为了评估菌丝霉素所潜在的治疗应用价值，本文通过生产菌丝霉素，并对其溶解性，抗菌活性及影响抗菌活性的因素进行研究。我们通过融合蛋白表达和柱上酶切，在大肠杆菌中得到高产量重组的菌丝霉素。在10%甘油的醋酸缓冲液中，加入0.5M精氨酸能显著增加菌丝霉素的溶解性，使菌丝霉素的溶解度从89ug/ml上升到408ug/ml。菌丝霉素在Tris-甘油-EDTA缓冲液的溶解度为846ug/ml。菌丝霉素具有抗革兰氏阳性菌肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌活性，其最小抑菌浓度分别为2ug/ml
2、和0.5ug/ml。对革兰氏阴性菌和真菌没有抗菌活性或很低的抗菌活性。菌丝霉素（128ug/ml）对兔子红细胞没有表现出溶血活性。减少二硫酥糖醇的浓度，菌丝霉素对金黄色葡萄球菌的抗菌活性会降低，表明二硫键对于抗菌肽最大活性是必须的。菌丝霉素通过生理作用和二价阳离子作用起到杀菌作用。抗菌活性会有微弱的减低在一定浓度依赖的二价阳离子下，然而，Ca离子浓度超过25mM，抑菌活性完全丧失。这些结果表明，二硫键的存在和二价阳离子的缺乏在菌丝霉素抗菌活性上扮演这一个很重要的角色。关键词：重组 菌丝霉素 溶解度 抗菌活性 二硫键 阳离子1 介绍菌丝霉素，是从腐生真菌上首先分离到的类似防御素的多肽。包括一个-
3、主体结构，由一个螺旋和两个反向股组成，通过3对二硫键来稳定结构(Cys4Cys30, Cys15Cys37 ，Cys19Cys39) 。它对肺炎链球菌有强烈的机制作用，包括那些对传统抗生素有耐药性的菌株，而且在生理离子浓度下也具有杀菌作用。对由肺炎链球菌引起的胸膜炎和肺炎的实验小鼠用菌丝霉素进行治疗，其效果与万古霉素和青霉素相当。菌丝霉素对A549细胞，正常人类支气管上皮细胞，肺成纤维细胞没有毒性，不引起转录，能刺激A549细胞产生IL-8因子，所以其被认为是相对安全的。这些结果表明，真菌菌丝霉素作为临床上潜在的抗生素替代品将会做进一步的研究和关注。菌丝霉素在中性PH条件下溶解性很差，有报道表
4、明，像葡萄糖，精氨酸，EDTA,二甲基亚砜等小分子能有效的抑制其聚集，从而便于蛋白质的正确折叠。我们猜测这些小分子可能是影响菌丝霉素的溶解度。防御素中二硫键被保留下来，一般认为对这一类型的多肽，二硫键在维持结果稳定和生物功能上起着重要的作用。然而，在菌丝霉素中二硫键的作用并没有完全弄明白。体外实验表明，多数防御素的抗菌能力收到阳离子的影响，特别在生理盐水存在的条件下进行评估。菌丝霉素在生理离子强度下表现出杀菌效果。但是阳离子对菌丝霉素对金黄色葡萄球菌的杀菌活性的确切的影响没有见到相关报道。我们通过大肠杆菌表达系统得到了重组的菌丝霉素，同时研究了小分子对抗菌肽溶解性的影响。我们对重组菌丝霉素的抗
5、菌谱和溶血活性都做了描述，并对二硫桥和离子对抗菌肽的抗菌活性影响做了研究。2 材料与方法2.1菌株和质粒E. coli DH5用来繁殖pET-32a(+)和pETplectasin 质粒, E. coli BL21(DE3)作为表达载体，抗菌活性检测的目标菌株是E. coli CVCC 195(K88), Pseudomonas aeruginosa CVCC 2087,S. aureus ATCC 25923 and S. pneumoniae CVCC 2350 均购于中国兽医药品监察所，2.2 重组表达和菌丝霉素纯化 成熟的菌丝霉素基因是根据大肠杆菌优势密码子通过反转录合成。由sango
6、n生物科技公司（中国上海）合成的包含一个BamHI识别位点，一个蛋白酶因子Xa切割位点，成熟的菌丝霉素编码基因，终止密码子，Xhol位点的DNA序列。经过BamHI，Xhol消化后，将DNA序列连接到pET-32a(+)上，构建重组的PET菌丝霉素质粒载体，将PET菌丝霉素质粒转化到大肠杆菌DH5内，然后在添加100ug/ml的氨苄青霉素LB琼脂平板上培养，通过DNA序列来鉴定质粒的正确链接和转化。在37下，将重组E.coli BL21（DE3）培养在含有100ug/ml的TB培养基里，至OD600为1.0。然后通过添加0.4mM IPTG诱导菌丝霉素基因表达。在30下，诱导表达的时间分别为0
7、h，1h，2h，4h，6h，16h。通过梯度离心（12,000 rpm, 5 min and 4 C），收集上清液，通过12%SDS-PAGE进行分析。1个湿重细胞经过5ml结合缓冲液（50mM NaH2PO4，300mM NaCl,10mM 咪唑，pH8.0）进行悬挂和细胞膜片段化处理（150W，65min of a 30% 工作周期）。细胞碎片通过梯度离心（12000rpm，20min，4）进行去除，上清液通过过His标签的Ni柱层析，用4柱体积的结合缓冲液进行平衡。用结合缓冲液洗便于后续基线吸收，融合蛋白的洗脱过程中4柱体积洗脱缓冲液的速率为1ml/min，分别用四种浓度20，50，80
8、，200，300，500mM咪唑进行洗脱。洗脱的产物用12%的SDS-PAGE进行检测。使用一种数量软件对蛋白质条带进行数量分析。2.3 硫氧还-菌丝霉素融合蛋白柱上切割和菌丝霉素的纯化重组细胞裂解后获得上层碎片被装载到已经平衡了的NiNTA树脂，用4柱体积的含有20mM咪唑的洗脱缓冲液进行洗脱。然后用Xa因子的缓冲液进行平衡，切割反应是在包含有20U Xa因子/ml柱体积的切割缓冲液中进行，温度为21，时间分别为0，6，12，24，48，96h。目的肽和His标签融合蛋白相继用4柱体积的和包含有200mM咪唑的洗脱缓冲液洗脱即可。通过0，6，12，24，48，96h切割分离得到相应的产物，并
9、通过麦黄酮SDS-PAGE进行了检测。目的肽在中国科学院生物物理研究所蛋白质组学实验室通过飞行时间解吸质谱检测。2.4 小分子对菌丝霉素溶解度的影响将菌丝霉素装入1000Da截留分子量的透析管中置于去离子水中透析，然后冻干，储存在-20用于活性测定。有四种小分子物质(10% glycerol, 0.5M L-Arg, 20% DMSO and 10mM DTT)被观察到其对菌丝霉素在两种溶液中溶解度有影响.除盐的菌丝霉素溶解在1mg/ml的0.01%HAc缓冲液中和TGE缓冲液（50mM Tris, 0.5mM EDTA, 50mM NaCl, 10% glycerol, pH 7.9），同时
10、含有1-3的四种测试物质。然后，在室温下，摇床孵化24h。梯度离心收集上清液（15000g, 10min），然后用不含-巯基乙醇的麦黄酮SDS-PAGE。使用一种数量软件对蛋白质条带进行数量分析（Version 4.6.2, Bio-Rad, USA）。2.5 抗菌活性和溶血活性的检测 柱切割后获得目的肽片段,过superdex柱进一步纯化，用0.015M NH4HCO3（pH 4.7）流速为0.5ml/min进行洗脱。活性片段进行冻干。用肉汤培养基对最小抑菌浓度进行检测。被测试微生物是处于对数生长期的培养在肉汤培养基中革兰氏阳性细菌，LB培养基中的革兰氏阴性细菌，和TPD中酵母菌。均稀释到1
11、105CFU/ml，使用相同的培养基。MH肉汤培养基中增添5%去纤维蛋白的羊血用于肺炎链球菌的培养。每小分100ul细胞溶液（1-5105CFU/ml）和两倍的肽稀释液进行温育孵化，在35下，大肠杆菌和铜绿假单胞杆菌孵化16-20h，金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌孵化24h，在28下，白色念珠菌孵化24h。对微生物100%抑制的所需要抗菌肽浓度被认定为最小抑菌浓度。每个实验重复三次。菌丝霉素溶血活性是通过以前所发表的方法来测定。每份中分别0.625，1.25，2.5，5，10，20，40，80，160，320，640，1280ug/ml 的菌丝霉素10ul和90ul的2.5%家兔红细胞无菌磷酸缓冲
12、液。37下孵化30min，样品于10000g离心3min，取上清液，置于540nm下测吸光度。溶血程度归因于1% Triton X-100 ，磷酸缓冲液被用来做对照。2.6 菌丝霉素的氧化还原性检测在10mM DTT溶液中，37下温育14和20h，纯的菌丝霉素会被还原。在20% DMSO溶液中，室温放置24h，菌丝霉素会被氧化。菌丝霉素还原和氧化均是通过不含有-巯基乙醇的麦黄酮SDS-PAGE和抑制作用区域法进行检测。2.7 一价和二价阳离子对菌丝霉素抗-金黄色葡萄球菌活性的影响要确定阳离子对菌丝霉素对金黄色葡萄球菌的抗性的影响，将以下样品，16ug/ml 的菌丝霉素，1105CFU/ml金黄
13、色葡萄球菌，4种梯度阳离子溶液（0300mM NaCl or KCl and 050mM CaCl2 or MgCl2)加入含有1mM磷酸缓冲液（pH7.4）的100ul体积，37孵化3h，然后，在37下至肉汤培养基培养24h。细菌被杀死的比例通过595nm下测定吸光度值来确定。Fig.1 最佳密码子核苷酸序列和相应的重组菌丝霉素氨基酸序列。氨基酸序列用单个大写字母表示，其写在对应密码子的第二个核苷酸下面。XhoI和BamHI的限制位点和Xa因子的切割位点用箭头标示。画线部分为成熟菌丝霉素的氨基酸序列。星号标识的是终止密码子。3 结果3.1 硫氧还菌丝霉素融合蛋白的表达和纯化硫氧还菌丝霉素融合
14、蛋白条带出现在23kDa附近，而理论相对分子质量为22566.4Da（Fig.2A）。经过4h诱导期后，融合蛋白最大产量达到了总蛋白的53.5%（Fig.2A），58.5%是以融合蛋白的形式存在（Fig.2B）。通过过His标签Ni2+-NTA柱从细菌细胞裂解液中分离纯化融合蛋白部分，洗脱液用80mM咪唑，每升含硫氧还菌丝霉素融合蛋白培养液得到纯度为94.9%的产量达到95.1mg。 Fig2. 重组的硫氧还菌丝霉素融合蛋白在大肠杆菌中的表达。（A）在大肠菌BL21（DE3）中表达的融合蛋白跑的SDS-PAGE。Lane1：大肠杆菌BL21（DE3）的总蛋白； Lanes 2 and 3：含有
15、PET-32a（+）的大肠杆菌BL21（DE3）经过IPTG诱导0h和4h的总蛋白；Lane4-9：经IPTG诱导0，1，2，4，6，16h表达后从大肠杆菌BL21（DE3）中提取的总蛋白量。（B）硫氧还菌丝霉素融合蛋白的不可溶部分，可容部分，和总细胞裂解液的SDS-PAGE （C）SDS-PAGE纯化硫氧还菌丝霉素融合蛋白。Lane1 和2：可溶和不可溶蛋白片段；Lane3：可渗透的顶端 Lanes4-9：从组氨酸标签Ni柱上洗脱纯化硫氧还菌丝霉素融合蛋白 ，缓冲液中咪唑浓度分别为20，50，80，200，300，500mM。Lane M：标准蛋白相对分子质量 3.2 硫氧还菌丝霉素融合蛋白
16、的Xa因子柱上切割Xa因子能切割四肽序列Ile-Glu-Gly-Arg，被用来除去纯化的硫氧还菌丝霉素融合蛋白中的硫氧还蛋白标签。为增加切割效率和重组多肽产量，柱上切割被作为制备菌丝霉素。经过第一次12h切割后，硫氧还菌丝霉素融合蛋白的量由90.5%降至74%，然后，经过96h切割后，降至51%，带有硫氧还蛋白的量和切割的菌丝霉素增加量相一致（Fig.3A）。经过12h柱上Xa因子切割后，在麦黄酮SDS-PAGE目标分子量处观察到目的条带（Fig.B），用飞行时间基质解吸质谱仪分析得到一个主要的峰，显示目的多肽片段的相对分子质量为4399.12-4407.12（Fig.3C）。这些结果表明重组菌丝霉素是一种混合存在形式，有三对二硫键的氧化态形式（相对分子质量为440
